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第二章 分子克隆的工具酶Enzyme used in molecular cloning 第一节 限制性核酸内切酶 限制酶切割DNA时对识别序列两端的非识别序列有长度的要求 第二节 甲基化酶 Methylase 第三节 DNA聚合酶 DNA polymerase 真核细胞有 4 种 DNA polymerase 原核细胞有 3 种 DNA polymerase 一、大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ E.coli DNA polymerase Ⅰ 2.用途 ② 合成cDNA 第二链 ③对 3’突出端的 DNA 作末端标记 (end labeling)（交换或置换反应） 二、Klenow DNA 聚合酶 1.活性 三、T4 噬菌体 DNA 聚合酶 T4 phage DNA polymerase 聚合活性与 Klenow 酶相似，但 3’→5’ 外切活性强 200 倍不从单链 DNA 模板上替换引物，在诱变反应中更有用，诱变率约提高 1 倍。使结合于单链 DNA 模板上的诱变寡核苷酸引物得以延伸 四、T7 噬菌体 DNA 聚合酶 T7 phage DNA polymerase 五、耐热 DNA 聚合酶 六、反转录酶reverse transcriptase 七、末端转移酶 terminal transferase 第四节 RNA聚合酶 RNA polymerase 1. 活性 第五节 连接酶Ligase 第六节 核酸酶nuclease 一、BAL31 核酸酶（BAL31 nuclease） 二、S1 核酸酶（S1 nuclease） 六、外切核酸酶Ⅲ Exonulease Ⅲ 本章小结 本章小结 本章小结 来源于米曲霉（Aspergillus oryzae） 活性： 可降解单链 DNA 或 RNA， 产生带 5’ 磷酸的单核苷酸或寡核苷酸双链 对 dsDNA、 dsRNA 和 DNA:RNA 杂交体不敏感 能作用于双链核酸分子的单链区，并从此处切断核酸分子 酶浓度大时可完全消化双链 中等浓度可在切口或小缺口处切割双链。??? 用途： 分析 DNA:RNA 杂交体的结构 去掉双链核酸中突出的单链尾从而产生平末端 打开双链 cDNA 合成中产生的发夹环。 4. 注意事项 ① 无3’→5’外切校正作用，在高dNTP和Mn2+时，每500bp就会有一个误掺入 ② 为防止新合成的DNA提前终止，需高浓度dNTP ③ 以寡核苷酸作引物,该酶可用于合成单链DNA模板. 也可以自身序列为引物用于双链合成，但效率低。自身互补的发夹型在所合成的双链cDNA中比例很小。50ug/ml放线菌素D可抑制第二链的合成。 来源于小牛胸腺，是存在于前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞内的一种不寻常的 DNA 聚合酶，是一种不依赖于模板的 DNA 聚合酶。分子量为60kD. 在二价阳离子存在下，末端转移酶催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3 -OH端 T 或 C →首选 CO2+ A 或 G →首选 Mg2+ 1. 活性 ② 低离子强度时，5’ –OH突出末端和平 端亦可，但效率低 2. 底物 ① DNA 可缩短至3个核苷酸， 3’ –OH突 出末端效率最高 ①在3’末端加同聚尾，cDNA或载体，便于克隆 3. 用途 ②末端标记 用标记的 rNTP、 dNTP 或 ddNTP 来标记 DNA 片段的 3 末端 来源于噬菌体感染宿主所产生 依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 DNA dependent RNA polymerase SP6 噬菌体 RNA 聚合酶 来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 LT2 菌株 T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合酶 来源于噬菌体感染的大肠杆菌 这些 RNA 聚合酶实际上为转录（transcription）中的 RNA 合成酶，识别 DNA 中特异的启动子（promoter）序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的合成。 与 DNA 聚合酶不同，无需引物，但需识别特异性位点。 2. 用途 ① 体外：合成 RNA 分子 将这些酶特异性的启动子安装在载体中，如pGEM-3Z载体（2.74kb），用于体外转录（合成）与外源DNA同源的单链RNA 从而用作杂交探针（hybridization probe）、体外翻译系统中的mRNA或体外剪接反应的底物 B. 酵母菌yeast 酵母启动子+T7 RNA poly基因置于 稳定的载体上 T7启动子+外源基因置于另一载体上 两者导入同一细胞可表达目的基因 将两段核酸连接起来的酶 1.T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase） 68kDa