神经细胞培养技术 41页.pptVIP

神经细胞培养 第一节：细胞培养的基本知识 　　　　常用的培养用液及培养基 培养用液：水 　　　　　　　　平衡盐溶液（ＢＳＳ） 　　　　　　　　消化液１胰蛋白酶液（０．２５%） 　　　　　　　　　　　２　二乙烯四乙酸二钠（ＥＤＴＡ）　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　　３胶原酶 培养基：天然培养基（血清，血浆，组织浸出液，水解乳蛋白） 　 　　　　　　合成培养基（ＭＥＭ　ＤＭＥＭ　ＨＡＭ　 　　　　　ＲＰＭＩ（１６４０）　１９９　Ｌ－１５等） 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 第 二节：神经细胞的培养技术 神经元的原代培养 神经胶质细胞的培养 神经干细胞的培养 * * 1定义： 　细胞培养 (cell culture)： 组织培养 　(Tissue culture) ： 　器官培养 ( organ culture)： 统称为体外培养 （In vitro) 2 组织或细胞培养的优点： 1）：研究对象是活细胞 2）：研究条件可以人为的控制 3）：研究的样本可以达到比较均一性 4）：研究的内容便于观察、检测和记录 5）：研究的范围比较广泛 6）：研究的费用相对比较经济 3 组织或细胞培养的不足：1）与体内条件存在差异 ；2）细胞培养存在一定的不稳定性 4 培养细胞的特性 1）培养细胞生长方式： a 贴附生长型细胞 （大多数） b 悬浮生长型细胞（少数） 2）培养细胞生长特点：贴附；接触抑制；密度依赖性 ５　细胞的生长过程： 原代培养：取自动物并置于体外培养中生长的细胞在传代之前称为原代细胞或原代培养． 传代培养：当细胞持续生长到达一定密度之后，将细胞分成两部分（或更多）至新的培养器皿并补充新的培养液为传代． 细胞系的生长过程： 有限细胞系：　原代培养　传代期　衰退期 无限细胞系：　滞留期　指数增长期　平台期 ０　２　４　６　８　１０　１２　２４　３４　４４ ２０ １８ １６ １４ １２ １０ ８ ６ 有限细胞系 无限细胞系 指数细胞数量 培养时间（周） 原代培养 细胞系阶段 ６ 培养细胞生长的条件 1）细胞的营养需要： a 基本营养物质 ：氨基酸 、维生素、碳水化合物及一些无机离子；b 促生长因子等物质 2）细胞的生存环境： a 温度：哺乳动物和人类为35~37℃；鸟类为38.5℃ b 气相及PH 值 ：O2及CO2的值： CO2=5%；空气=95%；PH=7.2~7.4 c 渗透压：260~320m mol/L 3) 无污染及无毒：体外培养的细胞必须生长于无污染及无毒的环境！！ 无毒：与细胞直接接触者—培养器皿、底物、培养基等；间接接触者—配制培养基的器皿、瓶盖、瓶塞等 无污染： 微生物及交叉污染 常用的平衡盐溶液（g/L） 一 神经元的原代培养(Primary culture) 常用试剂 1）DMEM 培养液：加10%热灭活胎牛血清，30m mol/L 葡萄糖，293.2mg/L L-谷氨酰氨，24.5m mol/L KCl，100mU /L 胰岛素，青、链酶素各10万μ／Ｌ，HEPES 2.8383g／Ｌ—PH 值7.2，过滤除菌，-20 ℃保存。 2） D-Hank`液（其中可加入牛血清白蛋白3g/L）（HBSS） 聚L -赖氨酸：处理培养皿（瓶）（10mg/L）5-10 min 3）细胞准备(大鼠神经细胞培养）： 新生1～3d SD大鼠，75%酒精浸泡约5min，移入超净工作台，无菌条件下开颅，快速取脑，置于D-Hanks液中，仔细剥除脑膜和血管，小心剥离脑组织，放入10ml小瓶中 剪碎，加入0.25%胰蛋白酶放入37℃培养箱，定期振摇促消化。消化约20min， 用含血清的DMEM培养液终止消化，吸管反复轻柔吹打，用200目不锈钢筛网过滤，将滤液分散组成制成细胞悬液，1000rpm/min离心、洗细胞两次，每次10min， 吸收少许细胞悬液，用血球记数板快速计数细胞数， 用含20%血清的DMEM培养基，稀释细胞制成1×106/ml细胞悬液，接种于经聚Ｌ赖氨酸处理过的24孔培养板（板孔放置0.8х0.8cm的小盖玻片）或培养瓶内，放入5%CO2培养箱，37℃培养。 ４）神经元的纯化：培养两至四天后用含5~10 ? mol/L 胞嘧啶阿拉伯糖的培养基培养24 hour ,然后改用常规培养液。 ５）神经元的鉴定：神经元特异性烯醇化酶（ Neuron specific enolose NSE）