第一章 7节 酶的纯化基本方法 酶工程课件.pptVIP

　 酶的纯化方法 　现行的方法（根据酶和杂蛋白在性质上的差异而建立的）： （一） 根据溶解度的不同； （二） 根据分子大小的差别； （三） 根据解离电学性质的特点； （四） 利用稳定性的差异； （五） 基于酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一的亲和作用的特点。 实际有许多方法中往往包含两种或两种以上的因素在同时起作用。;（一） 根据溶解度建立的纯化方法; 1 盐析法 盐析法是古老的、也是目前仍广泛采用的方法。 盐析法的原理：球蛋白类在低的盐浓度溶液中，它的溶解度随盐的离子强度升高而增大，表现“盐溶”特性。但是当盐浓度继续升高，超过某一上限值时，其溶解度又会先后以不同速度下降，分别“盐析”沉淀析出。盐析纯化法就是根据酶和杂蛋白在高的盐浓度溶液中溶解度的差别而建立的一种纯化方法。;　盐析应考虑下述因素： (1)pH (2)盐 (3)温度 (4)蛋白质浓度 (5)其它; (1)pH 　控制pH可以提高纯化效果，一般pH可选择的范围不大，大多数情况下，盐析的适宜pH接近于待纯化酶的等电点。有些情况，酶和杂蛋白能形成某种结合，从而干扰盐析分离，此时如控制pH使它们带相同电荷以减少络合物形成，这样盐析效果常会有所改善，但应注意酶在这种条件下的稳定性与盐的溶解度。; (4)蛋白质浓度 这是一个很重要的因素，它一方面能影响盐析效果的重现性，因为蛋白浓度不同，分级分离的范围也往往会发生变动；另一方面，蛋白浓度在100μg/ml以下，盐析一般很因难，有时甚至根本不能形成沉淀。在200μg—1mg／ml范围内，沉淀虽能生成，但时间较长，而且回收率往往不高。为了获得较好的盐析效果，蛋白浓度应在1mg／ml以上。; (5)其它 盐析沉淀通常至少要近一小时才能完成，沉淀可通过离心或压滤和母液分离。盐浓度低时，离心比较容易，而过滤较难；盐浓度高时，需要高速离心，但过滤较易。;常用的中性盐中最重要的是（NH4）2SO4，因为它与其他常用盐类相比有十分突出的优点： ? 1) 溶解度大：尤其是在低温时仍有相当高的溶解度，这是其他盐类所不具备的。由于酶和各种蛋??质通常是在低温下稳定，因而盐析操作也要求在低温下（0～4℃）进行。由下表可以看到， 硫铵在0℃时的溶解度，远远高于其它盐类： ? 2) 分离效果好：有的提取液加入适量硫酸铵 盐析，一步就可以除去75％的杂蛋白，纯 度提高了四倍。 ? 3) 不易引起变性，有稳定酶与蛋白质结构的 作用。有的酶或蛋白质用2～3mol/L浓度的 （NH4）2SO4保存可达数年之久。 ? 4) 价格便宜，废液不污染环境。 ; 盐析法的优点：简便、安全(大多数酶在 高浓度盐溶液中相当稳定)、重现性好。 缺点：分辨率低，纯度提高不显 著，同时为了下一步纯化有时还需脱盐。 ; 2.有机溶剂沉淀法 原理:不同的蛋白质需要加入不同量的有机溶剂才能使它们分别从溶液中沉淀析出。有机溶剂在这个过程的主要作用是降低溶液的介电常数，因为分子间的静电引力和溶剂的介电常数成反比，加入有机溶剂，蛋白质分子问的引力增加，溶解度降低。有机溶剂的另一作用是部分地引起蛋白质脱水而沉淀。但是有机溶剂的浓度和蛋白质溶解度之间目前还没有一个可用的关系式。;有机溶剂沉淀法应考虑的因素是： (1)温度 (2)pH (3)离子强度 (4)有机溶剂 ; (1)温度 这是非常重要的因素，因为大多数蛋白质遇到有机溶剂都很不稳定，特别是温度较高的情况(例如室温)下，极易变性失效，故操作过程通常应控制在0℃以下。而且有机溶剂必须预先冷却到-15—-20℃，然后在搅拌下缓慢地加入。沉淀析出后应尽快地在低温下离心分离，获得的沉淀也应立即用冷的缓冲液溶解，以降低有机溶剂浓度。 个别情况下，酶对有机溶剂比较稳定，此时操作可在较高温度(例如室温)下进行，这样有利于除去较多的杂蛋白。; (2)pH 蛋白质在等电点的溶解度最低，有机溶剂沉淀通常也多选在尽可能靠近待纯化酶的等电点pH条件下进行。如肌肉酶的分离在pH6.5效果一般较好，pH调整可用0.05M的缓冲液。; (3)离子强度 中性盐大多能增大蛋白质的溶解度，并能减少变性影响。在进行有机溶剂分级沉淀时，如果添加适当浓度的中性盐，如5—10％的硫酸铵，往往有助于提高分离效果。但盐的浓度一般不宜超过0.05M，否则沉淀不好，甚至沉淀全无，同时有机溶剂耗费也大。; (4)有机溶剂 丙酮的分离效果一般最好，引起失效的 情况与程度也较少(小)。除了丙酮外，乙 醇和甲醇等也常用。; 3 共沉淀法 原