PCR 技术及应用-JYH课件.pptVIP

七、PCR技术在临床检验中的应用 1、在常见病原体检测中的应用： HBV-DNA、HCV-RNA、EB-DNA、HCMV-DNA、MP-DNA、UU-DNA、CT-DNA、HSV2-DNA、NG-DNA 2、分子遗传学研究：基因变异、表达、重组、进化等 3、医学诊断：遗传病、基因病、癌变、代谢性遗传病等 4、法医学鉴定 5、组织器官移植配型：HLA-SSP配型 * Tm 值就是 DNA 熔解温度, 指把 DNA 的双螺旋结构降解一半时的温度 * PCR技术及应用 分子生物学诊断组 江杨华 2016年3月25日 星期五 PCR的定义 PCR的原理 PCR反应体系的的成分及其作用 PCR反应体系的优化 PCR技术的特点 PCR产物的检测方法 PCR技术在临床检验中的应用 一、PCR的定义 PCR（polymerase chain reaction) ： 聚合酶链式反应，又称体外DNA扩增技术。是近年来发展起来的一种体外扩增DNA片段的技术。 PCR技术是由美国 的Kary Mullis 于1985年发明，用此方法可以将微量目的DNA片段扩增一百万倍以上。由于PCR方法带来的革命性作用，Kary Mullis 本人因此获1993年诺贝尔化学奖。 二、PCR技术的原理 PCR技术，其原理是模拟天然DNA的复制过程：以拟扩增的DNA分子为模板，在DNA聚合酶的作用下，以一对分别与模板5′末端和3′末端互补的引物（寡核苷酸片段）引导下，按照半保留复制的机制合成新的子链DNA的过程，重复这一过程，即可使目的DNA片段得到不断的扩增。 二、PCR技术的原理 PCR反应主要分为三个步骤：变性、退火、延伸。 1.变性 (Denaturation)： 加热使模板DNA双链碱基间的氢键断裂而形成两条单链的过程。温度一般为90-95度。 2. 退火 (复性) (Annealling): 温度降低后，变性后的DNA与引物按碱基配对原则互补结合的过程。温度一般为Tm-5度。 二、PCR技术的原理 3. 延伸 (Extension): 在适宜温度下，在DNA聚合酶作用下，以4种 dNTPs等为 原料，从引物的 3′ 端开始，结合单核苷酸，形成与模板链互补的新DNA链的过程。 耐热DNA聚合酶最适温度为72 ℃。 上述 3 步为一个循环，每经过一个循环，样本中的DNA量就增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过35个循环后，理论上DNA的量可达到235倍。 PCR 的基本反应步骤 变性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm-5?C PCR的指数扩增（2n） 引物 5’ 5’ 3’ 3’ 第一次循环 第二次循环 第n次循环 二、PCR技术的原理 1. 缓冲液： 10 ～ 50 mM Tris- Cl (pH8.4)： 维持 Taq 酶作用环境的偏碱性 25 ～ 50 mM KCl： 促进引物退火，50 mM 会抑制 Taq 酶的活性。 100μg / ml 牛血清白蛋白 (BSA)： 对酶有一定的保护性，如质量不好将起相反的作 用，建议使用乙酰化的 BSA。明胶、Tween-20、 二硫苏糖醇 (DTT) 也有类似作用。 三、PCR反应体系的的成分及其作用 2. MgCl2 ： Taq 酶具有 Mg2+依赖性，显著影响反应的特异性和扩增片段的产量，浓度一般为1.5 ～ 2.0 mM，浓度过高能增加非特异扩增并影响产率，过低则酶活性显著下降。 3. dNTPs : dATP、 dGTP 、dCTP、dTTP。浓度一般为0.05 ～ 0.2 mM。 过高能加快反应速度，但可增加碱基的错误掺入 率和室验成本。 过低则反应速度下降，但可提高实验的精确性。 三、PCR反应体系的的成分及其作用 4. 引物 (Primer)：是一段寡核苷酸片段，即预扩增核酸片段两端的已知序列。浓度一般为0.2 ～ 1 uM，偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。 偏低：产量降低。 5. Taq DNA 聚合酶：耐高热，最初从火山口细菌中提取，具有连接酶活性和5 ’端至 3’端的外切酶活性。目前市售的均为克隆表达产物。 三、PCR反应体系的的成分及其作用 6. 模板DNA (Template): 可以是DNA，也可以是RNA，RNA的扩增首先需逆转录成cDNA后才能进行正常的PCR循环。 待扩增的核酸需部分纯化，使核酸标本中不含蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂以及能与DNA结合的蛋白质。 模板的量一般微克水平或102 ～ 105 拷贝， 过高会引起非特异产物的增加； 过低则产量降