脊髓ng2细胞在大鼠神经病理性疼痛中的作用及机制分析-role and mechanism of spinal cord ng2 cells in neuropathic pain in rats.docxVIP

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2018-05-26 发布于上海
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脊髓ng2细胞在大鼠神经病理性疼痛中的作用及机制分析-role and mechanism of spinal cord ng2 cells in neuropathic pain in rats.docx

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脊髓ng2细胞在大鼠神经病理性疼痛中的作用及机制分析-role and mechanism of spinal cord ng2 cells in neuropathic pain in rats

2.体外培养 NG2 细胞表面 AMPA 受体活化后疼痛相关介质表达的改变方法：使用percoll不连续梯度离心法从Sprague-Dawlye大鼠乳鼠海马中分离培养NG2 细胞，免疫荧光染色鉴定细胞性质，流式细胞技术检测细胞纯度。构建大鼠NG2基因的 shRNA慢病毒载体LV-NG2-RNAi及对照慢病毒载体LV-Con-RNAi，并检验慢病毒载体的干扰效能。体外培养NG2细胞接种于6孔板中，分为三组：对照组（n=12）：不添加任何试剂；AMAP组（n=12）：加入AMPA受体激动剂AMPA0.5mM；AMPA+CNQX 组（n=12）：同时加入AMPA受体激动剂AMPA0.5mM与AMPA受体拮抗剂CNQX50μM。于加药后1h、6h、12h、24h（每时间点3孔）使用Real-time PCR检测细胞NG2分子、神经营养因子BDNF、NGF与细胞因子IL-1β、TNF-α表达的变化。体外培养NG2细胞接种于6孔板中，分为两组：对照组（n=3）：加入LV-Con-RNAi 4d后加入AMPA受体激动剂AMPA0.5mM；实验组（n=3）：加入LV-NG2-RNAi 4d后加入AMPA受体激动剂 AMPA0.5mM。于加药后12h使用Real-time PCR检测细胞NG2分子、神经营养因子 BDNF、NGF与细胞因子IL-1β、TNF-α表达的变化。结果：成功体外分离培养了大鼠NG2细胞，细胞纯度可达80%以上。构建的慢病毒载体LV-NG2-RNAi的滴度可达8×108 TU/ml，干扰效率可达80%以上。Real-time PCR检测结果显示，NG2细胞表面AMPA受体活化后NG2、BDNF、NGF在给药后1h、6h、12h、 24h表达增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）；IL-1β在给药后6h、12h、24h表达增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）；TNF-α在给药后1h、6h、12h表达增高，与对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）。RNA干扰下调NG2分子表达后，Real-time PCR检测结果显示，NG2细胞表面AMPA受体活化后NG2表达降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）；BDNF、NGF、IL-1β、TNF-α表达降低，与对照组相比，差异有统计学意义（P0.05）。3.鞘内注射NG2-shRNA慢病毒载体对大鼠神经病理性疼痛的影响方法：选择成年雌性Sprague-Dawlye大鼠48只，体重220~250g，随机分为四组：对照组（Na?ve组，n=12）；神经病理性疼痛模型组（SNL组，n=12)；鞘内注射LV-Con-RNAi后7d制备神经病理性疼痛模型组（SNL+Con组，n=12) ；鞘内注射LV-NG2-RNAi后7d制备神经病理性疼痛模型组（SNL+NG2组，n=12)。术后7d使用western blot 检测大鼠脊髓腰膨大组织NG2蛋白的表达；同时提取大鼠脊髓腰膨大组织中NG2细胞，使用流式细胞技术检测NG2细胞神经营养因子BDNF、NGF与细胞因子IL-1β、TNF-α表达的变化；于术前、术后3d、7d、14d、21d、28d观察术侧后趾对机械刺激的50%缩爪阈值和辐射热刺激的缩爪持续时间。结果：western blot 检测结果显示，与Naive组相比，SNL组和SNL+Con组大鼠脊髓腰膨大组织中的NG2蛋白表达量增高（P0.05），SNL+NG2组大鼠脊髓腰膨大组织中的NG2蛋白表达量无明显改变（P0.05）。流式细胞技术检测结果显示，与Na?ve组比较，SNL组和SNL+Con组大鼠脊髓腰膨大组织NG2细胞BDNF、NGF表达增多，但 SNL+NG2组大鼠脊髓腰膨大NG2细胞BDNF、NGF表达无明显改变；与Na?ve组比较， SNL组、SNL+Con组和SNL+NG2组大鼠脊髓腰膨大组织NG2细胞IL-1β、TNF-α表达均增多。行为学观察结果显示，术前各组大鼠术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值与辐射热刺激缩爪持续时间差异无统计学意义（P0.05）；SNL组与SNL+Con组大鼠从术后3天开始各时点术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值降低，与Na?ve组比较差异有统计学意义（P0.05）；SNL+NG2组大鼠从术后14天开始各时点术侧后肢机械刺激50%缩爪阈值降低，与Na?ve组比较差异有统计学意义（P0.05）。SNL组与SNL+Con组大鼠从术后3 天开始各时点术侧后肢辐射热刺激缩爪持续时间增高，与Na?ve组比较差异有统计学意义（P0.05）；SNL+NG2组大鼠从术后7天开始各时点术侧后肢辐射热刺激缩爪持续时间增高，与Na?ve组比较差异有统计学意义（P0.05）。4. 统计学分析采用