常规分子生物学操作要点 知识介绍.pptVIP

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常规分子生物学操作要点;重组DNA技术的原理;*;*;;*;*;*; 实验设计 所需的各种DNA片段及其排列次序 ORF 酶切位点 实验方法和操作; 基因工程的操作过程;*;*;*;*;*;*;*;*;*;质粒DNA-碱裂解法原理;核酸的检测;原理;琼脂糖凝胶电泳;不同浓度琼脂糖凝胶的分辨能力 ;*;凝胶电泳的优点;常用的指示剂有溴酚兰和二甲苯青及银染色.溴酚兰在碱性液体中 呈紫兰色,在0.6%、1%、1.4%和2%琼脂糖凝胶电泳中,溴酚兰的迁移率分别与1Kb、 0.6Kb、0.2Kb和0.15Kb的双链线性DNA片段大致相同。二甲苯青的水溶液呈兰色,在 1%和1.4%琼脂糖中迁移速率分别与2Kb和1.6Kb的双链线性DNA相似. 指示剂一般与蔗糖、甘油组成载样缓冲液. 作用有①增加样 品密度.②在电泳中形成肉眼可见的指 示带,可预测核酸电泳的速度和位置.③使样品呈色,加样操作更方便 ;溴化乙锭染色;*;DNA分子大小的检测;提高转基因植物中外源基因表达的策略;SCMRP基因设计、合成;???3 植物表达载体pBENM的构建;ORF; 酶切位点 通过克隆载体引入酶切位点 通过PCR引入酶切位点(需测序) 部分酶切 Adaptor的使用 克隆的先后次序;通过克隆载体引入酶切位点;部分酶切;通用植物表达载体pBHT-5的构建 ;衔接头设计 BS1: 5’-GATCCGTACGTGGCCATTA-3’ BS2: 3’-GCATGCACCGGT-5’ SS1: 5’-CGGCCGACTGGAGCT-3’ SS2: 3’-GGAGCCGGCTGACC-5’;克隆的先后次序; 实验方法和操作 质粒DNA的提取 酶切与回收 连 接 转 化 转化子的鉴定; 质粒DNA的提取;酶切与回收;连 接;转化子的鉴定;PCR技术要点 引物的设计 PCR反应体系 PCR反应条件;引物设计的原则(一);引物设计的原则(二);引物设计的原则(三);Mg2+浓度; 退火(复性)温度与时间:;延伸时间:;基因克隆的一种方法 ——RACE;基于同源序列的克隆技术;Sequence analysis of gene GsCBRLK;Sequence analysis of gene GsCBRLK;目前,这种方法已引起国内外学者的广泛关注。在抗病方面已经应用很广泛,已在大豆,马铃薯、水稻、小麦、大麦、番茄和玉米中分离到了许多于已知抗病基因同源的DNA片段。 在植物渗透胁迫相关基因的克隆方面,Urao等利用这一方法,根据蛋白激酶保守功能结构区和CDPK特有的E-F手性结构区序列设计简并引物,从拟南芥中分离了编码CDPK的2个cDNA克隆(cATCDPK1和cATCDPK 2),并通过功能分析验证了这两个基因在植物抗渗透胁迫中的作用。这些研究证明了同源性克隆技术分离植物抗逆性基因的可行性。 ;基因克隆的一种方法-RACE;RACE的基本概念;3’RACE原理示意图;mRNA;RACE技术的关键环节;存在的问题及解决办法;提供一种改进的反转录方法;TdT加尾反应及其替代反应 首先在反转录后,一些无用的核苷酸和过多的cDNA引物的存在会干涉加尾的成功,降低目的cDNA加尾的有效性,从而导致第二链cDNA合成效率的降低。 其次,TdT反应难以控制,所有的cDNA都被加尾,而不管是否是全长cDNA,这样产生的非全长的cDNA将和全长产物一起完成PCR反应,而且会优先扩增,不能保证在PCR反应中有足够的全长产物能被探测。;TdT加尾反应及其替代反应 第三,若目的cDNA中含有与多聚尾互补的几个核苷酸同聚区,则在合成第二条cDNA链时引物的延伸会从内部序列而不是末端序列开始,产生非全长的第二条cDNA链。 我们所使用Invitrogen公司的RACE试剂盒,采用PCR介导的连接反应,在一定程度上避免了以上的问题。 RACE试剂盒中末端转移的是多聚C尾,这样在反转录合成第一链时5’端多聚G的二级结构影响反转录的彻底进行,会产生提前终止反应。我们改进了加尾的程序,用TdT酶加上多聚T尾,结果降低了反转录的难度,两个基因最终均获得了完整的5’末端。 ;RACE引物的设计 在实验过程中总结如下经验: 引物不能设计在保守区简并引物区。 各引物之间尽量不要重叠,由于引物的重叠,会引起很严重的引物多联体现象,不能准确地扩增。 尽量多设计引物,以减少PCR扩增的非特异性。也可以考虑在PCR鉴定阳性克隆的时候另设计一对引物,便于鉴定的正确性。;PCR扩增及产物的克隆 PCR扩增存在的问题 一方面可能未找到最佳扩增条件而导致产生许多不确定

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