第三章 结构蛋白（S第二节 胶原蛋白提取制备）方案策划.ppt

第二节 胶原的提取制备 第三章 结构蛋白 胶原制备技术复杂， 步骤繁多， 已日趋成熟， 我国已建成了一批胶原蛋白生产企业， 基本上能满足国内的需要： 化妆品、 临床医学、 组织工程 食品工业等 一、制取方法 蛋白质的一般提取、分离、纯化过程如下： ①破碎生物组织，用适当的缓冲液将蛋白质抽提出来； ②采用离心方法将细胞的亚细胞颗粒及细胞碎片与溶液分开； ③采用盐析或有机溶剂将有关蛋白质组分沉淀下来； ④进一步用色谱方法或电泳方法使各种蛋白质分开； ⑤在适当条件下使蛋白质结晶或制成冻干粉 制备胶原蛋白常用组织材料 胶原的提取， 一般有两种方法： 一是采用有机溶剂——化学方法； 二是采用酶——生物化学方法。 化学方法中， 根据所用溶剂的不同，可分为： 中性盐方法 酸性方法 用于提取胶原的组织材料， 必须进行前处理。 最重要的是要去掉非胶原性附属物， 如碎肉、脂肪等， 特别是要用有机溶剂(如丙酮等)抽提脂肪组织 胶原中一旦有脂肪混入， 无论进行中性还是酸性提取， 都无法除去， 最后只能得到乳浊状的胶原溶液。 （二）胶原的提取 经过前处理的组织材料， 还需进一步处理，如 除去骨组织中的钙和软骨组织中的蛋白多糖， 一般是先用0.5mol／L 乙二胺四乙酸 （EDTA） pH 7.4的缓冲液脱钙， 再用1 mol／L盐酸胍-0.05mol／L 三羟甲基氨基甲烷(Tris) - HCl(pH7.5)的缓冲液 在室温下去除蛋白多糖，接着， 再用大量蒸馏水洗涤 1、中性盐溶液提取 采用中性盐溶液提取组织材料中的可溶性胶原 中性盐溶液 0.15～1.0mol／L NaCl–三羟甲基氨基甲烷-盐酸(Tris–HCl)缓冲液提取 pH7.4左右 新生胶原 先用0.15mol/L的 NaCl溶液提取非胶原成分， 然后用0.45mol/L 或1.0mol／L的NaCl 溶液提取胶原。 在中性条件下胶原的变性温度为 40～41℃， 为了避免胶原变性， 一般需在4℃条件下提取。 为了减少组织中各种蛋白酶的降解作用， 在此缓冲液中可同时加各种蛋白酶抑制剂。 2、有机酸溶液提取 经中性盐溶液提取可溶性胶原后， 即可 采用稀有机酸提取酸溶性胶原。 稀有机酸溶液除了可以提取可溶性胶原外， 还可使多数组织溶胀， 打开其中含有醛胺类的交联键， 使这部分胶原即所谓酸溶性胶原溶解出来 胶原在酸性条件下的变性温度为38～39℃， 因此， 为了避免胶原变性， 需在低于变性温度下提取胶原， 一般控制在10℃以下进行。 酸性溶剂用pH 2.5～3.5的0.05～0.5mol／L乙酸 或0.15mol／L的柠檬酸缓冲溶液 (含蛋白酶抑制剂)。 稀有机酸溶液常用来 从年轻动物的真皮和肌腱中提取胶原， 从成年动物组织中只能提取Ⅰ型胶原。 可溶性胶原和酸溶性胶原被提取后， 需用一些蛋白酶将胶原进行限制性降解， 即将末端肽切割下来， 由于胶原肽链间的共价交联键 都是通过分子末端肽中的赖氨酸 或羟赖氨酸的相互作用形成的， 末端肽被切下后， 三螺旋结构的主体部分可溶于稀有机酸中 而被提取出来。 3、酶解 可用的蛋白酶有： 胃蛋白酶、胰酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶等。 常用的是胃蛋白酶， 在0.5mol／L 乙酸中加入一定量的胃蛋白酶， 于4℃下保温一段时间(24～48h)， 并施以缓慢或间断搅拌， 胶原被切去末端肽后， 以近似完整分子的形式被释放出来， 并溶解于0.5mol／L 稀乙酸中。 为了分离非胶原物质， 在胶原粗提液中加入较多的粉状盐 (一般是氯化钠) 或浓氯化钠溶液将全部胶原沉析出来， ——称为盐析。 通过分步盐析， 还可初步分离不同类型的胶原。 （三）盐析 在中性或酸性条件下盐析全部胶原， 所需的盐的浓度是不同的。 在中性时， 氯化钠的浓度需达到 4.0mol／L 或 20％， 在酸性条件下仅需 2.0mol／L 或 10％。 盐析后要静置一段时间才能看到沉淀 一般在加完盐后，充分搅拌， 再静置12～24h， 以便胶原充分析出， 再以 35000 r/min 的速度离心 1h， 收集沉淀物再用 0.5mol/L 乙酸溶解， 然后，进行透析， 以便除去沉淀中的盐。 这样的操作需重复2～3次， 可使样品中的非胶原物质含量降至5％以下。 二、胶原的分离纯化 胶原类型不同， 其氨基酸组成存在差异， 相对分子质量也不同， 运用不同的色谱技术和电泳技术， 可有效地进行胶原的 分离、 纯化。 （一）离子交换色谱 离子交换色谱是在常压～中压条件下， 分离、纯化单一类型胶原及其水解多肽的 一种较好方法。