现代生物技术 酶工程与蛋白质工程 教学 讲义.pptVIP

第七章 现代生物技术在蛋白质工程中的应用;一、蛋白质芯片技术; 蛋白质芯片(protein chip)也称蛋白质微阵列(protein microarray),是将大量蛋白质有规则地固定到某种介质载体上，利用蛋白质与蛋白质、酶与底物、蛋白质与其他小分子之间地相互作用检测分析蛋白质的一种芯片。 本质上就是利用蛋白质之间的相互作用对样品中存在的特定蛋白质分子进行检测，是从蛋白质水平去了解和研究各种生命现象。; 蛋白质芯片是通过将各种蛋白固定于滴定板、滤膜和载玻片等各种载体上成为检测用的芯片，然后用经过特定标记的蛋日质或其他成分与芯片作用，经漂洗将未能与芯片上的蛋日质互补结合的成分洗去，再利用荧光扫描仪或激光共聚焦扫描技术，测定芯片上各点的荧光强度，通过荧光强度分析蛋白质与蛋日质之间相互作用的关系，由此达到测定各种蛋日质功能的目的。; 绿色萤光蛋白最早是由下村修等人在1962年在一种学名Aequorea victoria的水母中发现。其基因所产生的蛋白质，在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色萤光。这个发光的过程中还需要冷光蛋白质Aequorin的帮助，且这个冷光蛋白质与钙离子(Ca+2)可产生交互作用。它是一种化学性能稳定的小分子蛋白质,它能在紫外光激发下发出易于检测的绿色荧光。gfp基因与目的基因相连接,不影响目的基因表达且能较好地标识出目的基因位置。现已证实它是一种重要的标记基因,在应用基因治疗胶质细胞瘤、探讨肿瘤侵袭机制与模式,以及研究肿瘤微血管构建等方面具有重要作用。 ; 在细胞生物学与分子生物学领域中，绿色萤光蛋白基因常被用作为一个报导基因(reporter gene)。一些经修饰过的型式可作为生物探针，绿色萤光蛋白基因也可以克隆到脊椎动物(例如:兔子上进行表现，并拿来映证某种假设的实验方法。 2008年10月8日，日本科学家下村修、美国科学家马丁·查尔菲和钱永健因为发现和改造绿色荧光蛋白而获得了当年的诺贝尔化学奖。;诺贝尔化学奖解读 “绿色荧光蛋白”让未知世界显影 　　当地时间10月8日11时45分，诺贝尔自然科学奖最后一个奖项化学奖在瑞典皇家科学院揭晓。3位美国科学家 ——美国伍兹·霍尔海洋生物学研究所日裔科学家下村修、哥伦比亚大学神经生物学教授马丁·查尔菲、加州大学圣迭戈分校华裔生物学家钱永健，因为发现了在生物化学领域极为重要的“绿色荧光蛋白”而获此殊荣，3人将平分1000万瑞典克朗 (约140万美元)的奖金。日本《读卖新闻》10月12日对该奖项进行了解读。 科学家接力研究发光生物 　　绿色荧光蛋白是一种能在蓝色波长光线激发下发出荧光的特殊蛋白质，正是这种神奇的性质，让它成为当今生物化学领域最有力的工具之一，被称为“生物北斗”。生物化学家们的研究对象常常是细胞、分子、基因等在显微镜下才会“现形”的物质。显微镜下的微观世界与我们看到的宏观世界极为不同，而GFP的作用是在微观与宏观间架起一座桥梁，让科学家通过观察发光效应推测出分子水平上的活动。这3位发现 GFP的科学家最终获奖，也说明了这一成果的重要性。 　　生物发光分为两种，一种是由生物体内一种荧光酶作为催化剂参与发光反应，另一种是生物体内某种蛋白质本身能发光。前者早在上世纪初就已被研究得较为全面，而发光蛋白质的系统研究起源于上世纪50年代下村修所做的开创性工作。; 1955年两位美国海洋生物学家达文波特与尼可，首次发现了水母可以发绿光，但他们无法解释原因，这一发现被下村修敏锐地捕捉到了。1961年，当时还在普林斯顿大学工作的下村修与同事们，在当地的星期五港附近收集了约一万只水母来研究，终于在一种叫做维多利亚水母的体内，分离纯化了水母中的发光蛋白——水母素。他们还发现了另外一种蛋白，它在阳光下呈绿色、钨丝下呈黄色、紫外光下呈强烈绿色。经过研究发现，这是钙离子在与水母素的交互作用中发生了能量交换，从而产生了发光效应(一种能量释放形式)。 　　1962年下村修与美国科学家弗兰克·约翰逊在美国细胞生物学权威期刊《细胞和比较生理学》上发表了相关论文，这是对蛋白质发光进行系统分析的最早论文。经过十几年的艰苦研究，1974年他们终于提取出了这种蛋白，这就是后来的“绿色荧光蛋白”。 　　下村修并未意识到GFP的重要应用价值，他离开普林斯顿大学到伍兹·霍尔海洋生物学研究所后，其同事道格拉斯 ·普瑞舍对GFP很感兴趣，1985年与1992年，普瑞舍分别提取出了水母素与GFP的DNA，在将其打造成“生物北斗”的过程中迈出了关键一步。 ; 此后，科学家们开始了将GFP在生物体内表达的研究。1994年，哥伦比亚大学的马丁·查尔菲，用GFP使秀丽隐杆线虫(一种通身透明、身躯纤细的线虫)的6个单独细胞有了颜色，引起轰动，科学界广泛意识