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间接 ELISA 实验方案 需要偶联二抗的需要偶联二抗的 ELISA 测定的一般程序和提示测定的一般程序和提示 需要偶联二抗的需要偶联二抗的 测定的一般程序和提示测定的一般程序和提示 缓冲液和试剂缓冲液和试剂：（：（查看直接查看直接 ELISA 实验方案的缓冲液和试剂实验方案的缓冲液和试剂）） 缓冲液和试剂缓冲液和试剂：（：（查看直接查看直接 实验方案的缓冲液和试剂实验方案的缓冲液和试剂）） 要得到准确的定量结果，通常做法是比较未知样品与标准曲线的信号。每个酶标板都必须测 定标准品 （两重测定或三重测定）和空白样，以确保准确性。 一般程序一般程序：： 一般程序一般程序：： 将抗原包被到微孔板将抗原包被到微孔板 将抗原包被到微孔板将抗原包被到微孔板 1. 将抗原在 PBS 或其它碳酸盐缓冲液中稀释至 20 μg/ml 的最终浓度。移取50 μl 抗原稀释液 到 PVC 微量滴定板的第一排微孔中，使该微量滴定板的微孔上包被抗原。按需要在微量滴 定板上进行梯度稀释。 通常将含纯抗原的试样以低于 2 μg/ml 的浓度加到微量滴定板上。纯溶液不是 必需的，但是原则上，试样中超过3% 的蛋白质应为靶蛋白 （抗原）。抗原蛋 白质浓度不应超过20 μg/ml，因为这将使微量滴定板上的大部分可用位点饱和。 确保样品所含抗原的浓度在抗体检测范围内。 2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时，或在4℃ 下孵育过夜。包被孵育 时间可能需要某些优化。 3. 弃去包被液，并在微孔中加入200 μl PBS，洗涤微量滴定板三次。在水槽上方轻轻甩动微 量滴定板，除去溶液或洗涤液。在纸巾上轻拍微量滴定板，除去剩余的液滴。 封闭闭 闭闭 4. 通过每孔添加 200μl 封闭缓冲液 （5% 脱脂奶粉或 5% 血清/PBS ），封闭包被孔中剩余的蛋 白质结合位点。替代封闭剂包括blockACE 或 BSA。 5. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育至少 2 小时，或如更方便的话，则在4℃ 下孵育过夜。 6. 用 PBS 洗涤微量滴定板两次。 间接 ELISA 实验方案 用一抗和二抗孵育用一抗和二抗孵育 用一抗和二抗孵育用一抗和二抗孵育 1. 将 100 μl 已稀释的一抗添加到每个孔。 2. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 2 小时。此孵育时间可能需要优化。2 小时通常足以获得强信号，但如若获得弱信号，则当在 4℃ 下孵育过夜时往往会观察到 更强的染色。 3. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。 4. 添加 100 μl 偶联二抗，其在使用前便已在封闭缓冲液中稀释成最佳浓度 （依照制造商说 明书）。 5. 用粘合塑料制品覆盖微量滴定板并在室温下孵育 1-2 小时。 6. 用 PBS 洗涤微量滴定板四次。 检测检测 检测检测 虽然有许多不同类型的酶可用作检测虽然有许多不同类型的酶可用作检测，，但是辣根过氧化物但是辣根过氧化物 (HRP)(HRP) 和碱性磷酸和碱性磷酸 (ALP)(ALP) 是是 ELISA 测定中广泛使用的两种 。某些生物材料具有高水平内源酶活性 （例如肺泡细胞中的 高水平 ALP、红细胞中的高水平过氧化物 ），考虑到这一事实是非常重要的，这可能会导 致非特异性信号。如有必要，用左旋咪唑 （针对 ALP）或用 0.3% H O 的甲醇溶液 （针对过 2 2 氧化物 ）进行另外的阻断处理。 ALP 底物底物 底底物物 对于大多数应用，pNPP （对硝基 磷酸盐）是最常用的底物。在室温下孵育 15-30 分钟后， 可在 405 nm 处测定硝基苯酚呈现的黄色。（该反应可通过添加等体积的 0.75 M NaOH 终 止 ）。 HRP 显色液显色液 显色液显色液 HRP 的底物为过氧化氢 。过氧化氢的裂解与氢供体的氧化偶联，反应期间氢供体的氧化使颜 色发生变化。 间接 ELISA 实验方案 TMB （3,3’,5,5’- 四甲基联苯胺 ） 将 TMB 溶液添加到每个孔，孵育 15-30 分钟，添加等体积的终止液