在生物制剂中蛋白质微粒检测问题的发展——目前状态 李瑞雪.pptVIP

在生物制剂中蛋白质微粒检测问题的发展——目前状态 摘要： 生物制剂的聚集和颗粒的形成在生物治疗方面仍然是主要的质量问题。存在大量的聚集被认为是造成有害免疫反应的原因之一。蛋白质微粒形成的尺寸和形状的范围很宽。因此，颗粒物的综合表征在生物制剂方面仍然具有挑战性。在稳定的生物制剂中小尺寸的生物聚集体能够通过精确的分析技术得到很好地控制。（例如，高性能液相色谱法）。在临床和商业制剂中颗粒监测使用视觉检测和显微镜下才能看到的颗粒计数分析。 这是公认的研究方法在亚微米颗粒（＜1um）和低微米（1~10um）范围内，可以为了解颗粒的形成机制提供重要的线索。最近几年颗粒更全面的表征新技术的发展显著增加。在过去的五年中，由于受学术的文章，评论，和各种论坛热烈讨论的影响，增加了在这一领域的研究意识。本文概述了提供互补的表征数据涵盖更广颗粒尺寸范围的新兴的检测技术。它也讨论了它们在生物治疗药物发展方面的优点和局限性。 引言： 1、在过去的十年被批准的生物治疗药物未满足医疗要求，越来越多的组织和学术机构参与生物制剂研究，对于生物化学和生物物理许多类型生物分子的了解在过去的十年有显著的改善，如抗体、融合蛋白、与药物结合物。 2造成担忧的三个主要因素：a、对于生物制剂中聚集和颗粒物的形成缺乏足够的了解；因此，对微粒的形成缺乏可预见性。b、不知道微粒数量和不良事件发生的相关性。c、不同于其它的降解途径，它是由一个单一的分析技术测定微粒的一个挑战，因为它们可以在很宽的尺寸范围内形成。 3、低聚物的形成发生通过共价键或非共价结合，聚集是能够导致大型颗粒和小型聚集体的主要途径。 4、微粒通常涉及大尺寸的种类在几十微米到亚毫米和毫米尺寸范围内并且通过人的眼睛分辨：可见的（100um）或显微镜可见的（10um）。然而，在亚微米级和低微米（1~10um）大小区域探索能够提供与颗粒形成机制有关的重要的数据。通过该领域的许多研究人员指出，生物制剂颗粒也可能来自外部资源，当临床和商业用途的药在严格控制的环境中制造时，外源性颗粒的发生会减少。 5、除了非低聚物，聚集体也可以由天然的单体低聚物形成，单体保持他们的二级和三级结构，了解内源的单体形成的低聚物和外源配合物是否有同样的安全风险是重要的。然而，基于尺寸的探究技术很难探索蛋白质结构的不同。本文主要讨论基于尺寸的检测技术，但应该指出的是，聚集体和颗粒的体外综合表征应该包括生化/分析，蛋白质的二级三级结构，和生物活性的测定。 6、蛋白质化学，蛋白质折叠，和生物制剂的制造在过去几十年的研究中取得了重大的进展。尽管有了这些进步，但是对于聚集体和颗粒的形成和预防途径的了解相对较少。文章强调的主要问题是用显微镜观察或在亚微米尺寸范围内定量的测定颗粒。也描述了技术改革的重大意义对于提高检测和表征技术能够帮助找到预防策略。 正文（六大部分） 一、尺寸和数量的连续统一性 二、颗粒计数分析 1、视觉检测和可见的颗粒表征 2、遮光实验和在显微镜下才能看到的颗粒物源 3、膜显微镜 4、尺寸排阻色谱法 三、颗粒表征实验 1、动态图像分析 2、激光衍射分析 3、动态光衍射 4、拉曼/红外光谱成像 5、荧光显微镜 6、库尔特计数器 7、流式细胞仪 8、悬浮微谐振器 9、纳米粒子跟踪分析 10、TEM、SEM、AFM 四、颗粒形成机制 五、不良事件的关注 六、结论 一、尺寸和数量的连续统一性 一种精密的分析检测如尺寸排阻高效液相色谱法能够将蛋白质单体从二聚体和其他小尺寸的聚集体中分离出来，并且能够根据所使用的色谱柱的类型提供一个从20纳米到30纳米的动态的范围。没有其他的技术能够达到相同的分辨水平，并且能够稳健的和重复性的匹配。紫外探测器的灵密度对于定量聚集体具有重要的作用，因为在许多单体存在的条件下通常只有一小部分聚集体能够被检测。利用SEC技术使用紫外探测器能够测量含量低至0.1%~0.5%的聚集体。 其他的检测物如光散射和荧光可以增加检测的灵敏度，但无法实现可靠的定量分析。考虑到当前尺寸范围和质量水平检测的现状和差距，有人可能问是否有可能制定一个分析SEC系统能够检测1纳米到100微米连续的种类和从皮克到微克量连续检测单体和聚集体。 只可惜，现今没有这样的技术可以覆盖广泛的尺寸和质量。目前的做法归结为（a）、对于生物候选制品的风险品估基于观察到的临床开发的趋势。（b）、基于以上的风险评估选择合适的正交分析和生物物理方法。（c）、在分析的过程中收集数据在颗粒制剂形成的环境中建立一个全面的分子轮廓 二、颗粒计数分析 三、颗粒表征实验