实验2.3 SDS-PAGE制备电泳和转移电泳.pptVIP

L O G O 实　验　2.3经非变性制备电泳初步纯化的GFP的SDS制备电泳与转移电泳（教材“实验十”的第一、二阶段）血清抗体的快速亲和纯化（教材“实验十”的第二阶段） 一、实验内容 将非变性PAGE制备分离的GFP用变性条件下的SDS再纯化一次 将凝胶上的蛋白条带转移到NC膜上 剪下膜上的GFP蛋白条带，作为亲和纯化用的固相抗原，来纯化GFP的血清抗体 SDS制备电泳+转移电泳+亲和纯化 二、实验材料 (一)材料 浸泡过夜的GFP蛋白溶液 NC膜 滤纸 二、实验材料 (二)试剂 1、1.5mol/L Tris-HCl pH 8.8 2、0.5mol/L Tris-HCl pH 6.8 3、30%　Acr/Bis 4、10%SDS 5、10%Ap(-20℃存放) 6、0.1%溴酚蓝：0.1g溴酚蓝溶于100mL水中 7、2×SDS－PAGE样品缓冲液 8、5×SDS电极缓冲液 双蒸水溶解，定容至500mL，使用时稀释5倍使用。 9、TEMED 10、预冷丙酮 11、0.1mol/L Tris-HCl pH 6.8 12、转移电泳缓冲液 13、10×PBS贮存液 14、丽春红染色液 15、兔抗GFP血清抗体 16、抗体洗脱液 二、实验材料 (三) 仪器设备 垂直电泳槽 电泳仪 台式高速离心机(5mL离心管) 台式高速离心机(1.5mL离心管) 恒温水浴锅 转移电泳槽 搪瓷盘、小塑料盒、剪刀、镊子 烘箱 　　　　　　　 三、实验步骤 (一)GFP的制备SDS、用0.75mm夹条的玻璃板做胶，详见教材“实验十二” 注意：1)分离胶和浓缩胶中均加入SDS 2)做浓缩胶时不加梳子，用水封顶，使浓缩胶的顶部形成一平面 3）浓缩胶的顶部预留足够空间便于加样 2、样品制备： 1)丙酮沉淀：取实验2.2中非变性制备后浸泡过夜的GFP蛋白溶液，转移到5mL离心管中，加4倍体积的冷丙酮，混 匀，冷冻20min。8000r/min，5min离心。取沉淀。在通风橱中令丙酮完全挥发。 2)加入0.1mL的0.1mol/L Tris(pH 6.8)，加入等体积的SDS样品缓冲液。 3)沸水浴加热5min。 4)离心： 14000r/min，3min 三、实验步骤 3、上样 4、电泳 5、后处理用适当大小的滤纸贴在凝胶上，小心地将凝胶从玻璃板上剥离下来。 三、实验步骤 (二 )转移电泳 1、浸泡膜、海绵等 将剪下的与胶大小一致的NC膜浸泡于转移电泳缓冲液中约20min。同时，浸泡海绵。 2、转移电泳“三明治”的制作 注意：顺序 3、转移电泳：200mA，1h 注意：正确接通正、负极 三、实验步骤 (二 )转移电泳 4、后处理：电泳结束，取出膜，丽春红染色；剪下染色明显的条带，80℃烘20min，备用 经非变性胶制备分离的GFP胶条，浸泡洗脱下来的蛋白再经变性胶电泳，再转移到AC膜后用丽春红染色的结果。GFP（#标记）是其中最主要的成分，它前面的条带（*标记）可能是GFP的降解产物，还可以看到一些含量较少的其他杂蛋白条带。将GFP条带从膜上剪下后稍加处理，即可用于GFP血清抗体的快速亲和纯化。 * # 三、实验步骤 (三 )亲和纯化 1、封闭 2、加入兔抗GFP血清100μL，处理1h 注意：收集去除了特异性抗体后的血清 3、漂洗 4、洗脱　 　注意：严格控制时间！ 5、取出膜条，中和洗脱液，4℃保存备用！ L O G O