实验六苯硫脲尝味的群体遗传学调查.docVIP

实验六 苯硫脲尝味的群体遗传学调查实验目的测定人群中PTC 尝味基因的表现型和基因型， 理解孟德尔遗传基因型与表现型的对应关系。2．了解酶切扩增多态序列（又称为PCRRFLP）技术的原理，学会用PCRRFLP 技术检测单核 苷酸多态性 （SNPs）。在分子水平上测定PTC 尝味的基因型。实验原理苯硫脲（phenylthiocarbamide，PTC）是硫脲的苯基衍生物，为白色结晶粉末， 因含有硫代酰胺基（N-C=S）官能团而有苦涩味。能尝出1/750,0001/50,000 PTC浓度溶液味道的人（苦涩味，少数人感到甜味） 称为苯硫脲尝味者, 只能尝出PTC 浓度大于 1/24,000 溶液的味道的人称为苯硫脲“味盲者（nontaster）”PTC 尝味能力是受单基因控制的孟德尔遗传性状，是由位于7 号染色体的一种苦味味觉感受器基因 TAS2R38 决定的，属于常染色体不完全显性遗传。尝味者中显性基因T的纯合子(TT)能尝出1／750,0001／6,000,000 的PTC 溶液的苦味，杂合子(Tt) 只能尝出1 ／480,000l／380,000 的PTC溶液的苦味。人类的 PTC 尝味基因又名 PTC、T2R38 或 T2R61。绝大多数尝味者与味盲者的 区别在于三处单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs)：一处是145 位，味盲者为 G145（编码丙氨酸ala），尝味者为C145（编码脯氨酸pro）；第二处是785 位，味盲者为T785（编码缬氨酸val），尝味者为C785（编码丙氨酸ala）；第三处 在886 位，味盲者为A886（编码异亮氨酸ile），尝味 者为G886（编码缬氨酸val）。因此味盲者PTC 多肽中三处对应的氨基酸分别是ala49、val262 和ile262， 被称为AVI等位基因，而尝味者的三处是pro49、 ala262 和val262，被称为PAV等位基因 图1 PTC 尝味基因味盲者的PTC 编码区有五个限制性内切酶 Fnu4H1 的识别位点（识别序列5’-GC↓NGC3’），如果是尝味者，则其第785 位SNP 恰好形成了一个额外的Fnu4H1 识别位点（GCTGC）。 因此可以利用这个SNP 造成的限制性位点多态性，设计引物扩增包含785 位SNP位点的PTC Fnu4H1 基因编码区的一部分，然后用Fnu4H1切割扩增产物，根据是否能把扩增产物切开而判定是某个人的单倍型（haplotype）。 图 2 味盲者PTC 尝味基因编码区序列 三、实验用品1．DNA、引物和（20μΜ）、TaqDNA聚合酶（5U/μl）10×PCR反应缓冲液、dNTP（2.5mM）、灭菌蒸馏水、限制性内切酶Fnu4H1（20U/μl）、10×酶切缓冲液。2．2%的琼脂糖凝胶、×TAE、6×上样缓冲液、DNA Marker、。3．PCR仪、、微量加样器（μl、20μl、200μl）、枪头（20μl、200μl）及离心管(1ml、0.5ml)、容器盒、恒温水浴箱、琼脂糖凝胶电泳装置、烧杯、保鲜膜、封口膜、微波炉、250ml三角烧瓶、透明胶带、托盘天平、台式高速离心机。 （1）每实验小组选取1 名受试者，用灭菌牙签刮取口腔上皮细胞。 （）在1.5 ml 灭菌微量离心管中加入100 μL 灭菌水。 （）受试者用无菌牙签轻刮口腔腮内侧，刮下来的细胞在灭菌水中漂洗。 （）涡旋振荡器涡旋振荡混匀10 s（）离心机瞬时离心10 s。 （）沸水浴中煮沸5 min。 （）离心机13200rpm 离心2 min。 （）基因组DNA 4°C 保存备 上游引物：hPTC Forward 5’-aactggcagaataaagatctcaatttat-3’ 下游引物：hPTC Reverse 5’-aacacaaaccatcacccctatttt-3’按以上次序，将各物质加入到一只无菌的0.ml离心管中。轻轻混匀后，离心5秒钟，加入一滴液体石蜡盖于反应混合液的表面，然后放入PCR仪中进行循环反应。反应体系μl其成分如下：置37水浴消化1小时，4保存琼脂糖凝胶电泳检测（1）胶板的准备取有机玻璃内槽，洗净晾干。取透明胶带将有机玻璃内槽的两端边缘封好（注意，将透明胶带紧贴于有机玻璃内槽的两端边上，不要留空隙）。将有机玻璃内槽置于一水平位置，在距离底板0.5~1.0ml的位置放入梳子。（）2%的琼脂糖凝胶的制备称取1克琼脂糖，置于锥形瓶内，加入50ml 1×TAE，瓶口用保鲜膜封盖，在微波炉中加热直至琼脂糖全部溶解，得到2%琼脂糖凝胶液，待其冷却至65左右，加入2.5μl溴化乙啶贮存液（10mg/ml），使溴化乙啶终浓度为0.5μg/ml。小心混匀并倒在有机玻璃内槽中，控制灌胶速度，使胶液缓