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荧光定量常见问题集锦 刘育林 WWW.EastWin.Com.Cn 目的 新技术 新问题 标准 成功 方法 对象 目录 一、概念 二、前期问题 三、准备问题 四、反应中问题 五、反应后数据分析 六、结果问题 七、特殊问题 八、恐怖问题 END、信息交流 概念 谁会用到realtime qPCR？ 基本原理是什么？ …… 谁会用到realtime qPCR？ 精确的DNA定量 微生物检测 病毒拷贝数（医疗） 检验检疫 转基因 相对的DNA定量（差异） 基因表达差异 甲基化研究 SNP 基本原理 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，最终精确的对起始模板定量分析 基本原理 常用荧光检测方法 SYBR 非特异性 DNA小沟 TaqMan 特异性 与扩增的片断配对 基本原理 前期问题 荧光定量要多少钱？ 我应该选用那种荧光标记方法？ ……. 荧光定量要多少钱？ SYBR方法： ＝PCR反应体系＋SYBR染料＋管子 ＝0.5+0.02+0.6 ＝1.0~1.5元 TaqMan方法： ＝ PCR反应体系＋探针＋管子 ＝0.5+1.5+0.6 ＝～3.0元 荧光定量要多少钱？ Northern 标记试剂盒＋膜＋同位素＋时间 10元 我应该选用那种荧光标记方法？ 医疗检验 TaqMan探针法 特异 准确 科研 SYBR方法 便宜 方便 TaqMan探针法 要求严格的相对定量 SNP等需要多色标记的研究 目前都有那些品牌的机器？ ABI MJ BioRad Roche Rotorgene Stratagene 准备问题 荧光定量PCR的反应体系特殊吗？ 怎么作标准品？ …… 荧光定量PCR的反应体系特殊吗？什么酶可以做？ 类似于普通PCR SYBR，抑制问题 TaqMan，探针的退火 普通的Taq酶都可以胜任 TaqMan，5’外切酶活性 反应体系的调节 Mg2+，DMSO 荧光定量PCR的反应体系特殊吗？什么酶可以做？ PCR反应体系 SYBR I（25ul） 10×PCR Buffer 2.5ul dNTP mix 2ul Primers Final 0.6uM Taq 0.25ul SYBR I 0.25~0.5× 荧光定量PCR的反应体系特殊吗？什么酶可以做？ TaqMan 10×PCR Buffer 2.5ul dNTP mix 2ul Primers Final 0.6uM Taq 0.25ul Probe Final 0.2~0.3uM 探针和引物怎么设计？ 引物设计原则 普通PCR引物设计 产物长度：75bp~150bp TaqMan探针的设计 探针尽量靠近5‘端 5‘末端不能是G 探针长度不应小于13 bp 避免一连串的重复碱基序列 Tm 为65～70 ℃ 要求待检测的SNP 位点最好位于探针中间, 3‘端可以引入化合物基团MGB, MGB 有显著提高探针Tm 值的作用 探针和引物怎么设计？ 设计软件 Primer Express Beacon Designer 公司合成（探针） 上海博亚 上海生工 宝生物 上海基康 探针和引物怎么设计？ 特殊关注 TaqMan探针，保证探针识别模板的唯一性（设计时作BLAST）；多标交叉反应 相对定量的扩增效率与引物和探针设计有关，尽量保证扩增效率的一致 双标准曲线法还是??Ct法？ 相对定量方法 基因表达差异 目标基因，内标基因 ??Ct 只依靠Ct值 用于大通量（很多基因，如芯片结果） 计算简单 估计性的结果 要求目标基因和内标基因扩增效率都比较好 双标准曲线法还是??Ct法？ 双标准曲线法 结果精确 对扩增效率要求不高 构建目标基因与内标基因的标准品 相当于两个绝对定量 每次反应都要作标准曲线 用什么作为内标基因？ 内标基因的目的：用来均一化目标基因，即保证目标基因的比较在一条水平线上 最常用的内标基因 β-actin，GAPDH 选用的 18S 表达恒定并不被处理影响的基因 容易扩增 如何制作标准品 荧光定量标准品 主要用于绝对拷贝数定量 包含扩增片断的质粒，或者基因组DNA 步骤 用设计的引物从待检测样品中扩增产物片断 纯化后装入T-Easy载体，测序 从菌中提取并纯化质粒，用分光光度计定量（ug/ul) 如何制作标准品 一个质粒的质量 公式的推导 一个碱基核苷酸对的平均分子量为660g/mol 阿伏加德罗常数为6.023╳1023 则每对碱基核苷酸对质量为分子量除以阿伏加德罗常数 再将DNA长度乘上每对碱基核苷酸对质量就得出双链DNA的质量 如何制作标准品 计算出拷贝数（copies/ul） 梯度稀释制作标准品（大体积稀释10ul to 90ul） 定量PCR，检查Ct值差异，正常为~3.2 产物跑胶鉴定大小。