微生物分离之涂抹法划碟法倒碟法壹原理分离微生物经由增殖.docVIP

微生物分離之塗抹法、劃碟法、倒碟法 壹、原理 分離：微生物經由增殖步驟可將欲研究的菌種於選擇性培養基中大量繁殖，然而可能仍有少數其他菌種存於其中，無法純化，因此有必要進一步利用分離技術，將微生物分離成一獨立菌落，達成純種培養。分離方法之原理主要是藉使菌數漸次遞減，最終達成單獨分離之目的，常用的方法包括： 倒碟法：或稱為注入培養又稱為混合稀釋法，此法的步驟為將樣品先以接種環或吸管進行連續稀釋，接著各取1ml的稀釋菌液連同40~50度熔融狀態的固體培養基一齊置入已滅菌之培養皿中，搖動混合均勻靜置等待凝固後置於恆溫培養箱中予以培養，即可得到分離的菌體，此法通常不須要技巧，即可獲得極佳的分離效果，並可用於微生物的計數。 劃碟法:利用接種環將待分離的液體樣品均勻地劃於固體培養基表面，如此可將混合生長的菌落分離成單一菌落，達成純種培養之目的，此方法比倒碟法更需要技巧，方能把菌體分開。 塗抹法：滴入少許菌液於培養皿上，利用三角豌棒塗抹菌液使其均勻分佈於固體培養基表面，此方法常用於菌體計數。 貳、設備 (一)器材 1.錐形瓶 2.玻璃培養皿 3.接種環 4.三角彎棒 5.吸球 6.定量玻璃吸管 7.取藥杓 8.酒精燈 9.螺紋試管 10.試管蓋 11.玻棒 12.鋁箔 13.棉花栓 14.隔熱手套 15.簽字筆 16.秤藥紙 17.滅菌袋 18.燒杯 19.酒精噴灑器 20.試管架 (二)儀器 1.電子天平 2.電磁加熱攪拌器 3.高溫高壓滅菌釜 4.水浴鍋 5.無菌操作檯 6.微風恆溫培養箱 7.冷藏箱 參、操作流程 1.菌種分離一般有塗碟、倒碟和劃碟 2.塗碟法 (a)將菌液連續10倍稀釋，，，， (b)三角彎棒浸於酒精溶液中，取出，以燃燒法將酒精燃盡後，降溫才可塗碟。 (c)塗碟時，用三角彎棒將菌液均勻塗抹於培養基上。 (d)放於37度培養箱培養，觀察及計算菌數一般以30~300個菌為主。 (e)將菌數回推原液菌/ml，必要時取平均值標準偏差。 3.倒碟法 (a)記錄菌種來源，將菌液進行連續10倍稀釋，，，， (b)配置豐富培養基每個培養皿25ml共5個培養皿，共125ml，推算豐富培養基與二段水混合後，放置於高溫高壓滅菌釜後，待其冷卻。 (c)培養基冷卻時，要注意不能讓其凝固，待培養基約45~50度時，將稀釋好之菌液加入，充分混合，在倒入空的滅菌過之培養皿。 (d)放於37度培養箱培養，隔天觀察並計算菌數，推回原液菌數。 (e)與塗碟法結果作比較。 4.劃碟法 (a)各組取5個含豐富培養基之培養皿，將接種環以火燄燃燒法烤至通紅，將接種環伸入菌液取樣。 (b)在凝固之培養基上開始劃碟，注意路徑不要重複，完成第一次劃碟。 (c)完成第一次劃碟後，將接種環再以火燄法法滅菌，此時要先讓接種環在培養基空白處降溫，再以部分第一次劃碟區域為菌來源劃第二次碟。 (d)如此重複直至完成四次劃碟。 肆、菌種 大腸桿菌 伍、實驗結果表格 塗碟法 稀釋倍數 菌落數 無法計數 無法計數 無法計數 193 65 劃碟法 稀釋倍數 菌落數 43 33 18 11 6 倒碟法 稀釋倍數 菌落數 無法計數 無法計數 無法計數 無法計數 54 陸、實驗結果照片 塗碟法10倍稀釋 塗碟法100倍稀釋 塗碟法1000倍稀釋 塗碟法10000倍稀釋 塗碟法100000倍稀釋 劃碟法10倍稀釋 劃碟法100倍稀釋 劃碟法1000倍稀釋 劃碟法10000倍稀釋 劃碟法100000倍稀釋 倒碟法10倍稀釋 倒碟法100倍稀釋 倒碟法1000倍稀釋 倒碟法10000倍稀釋 倒碟法100000倍稀釋 柒、問題討論 1.討論以三種分離技術所得之實驗結果是否成功地分離微生物，即在培養基上形成單一菌落？若無單一菌落，說明實驗可能失敗的原因。 答:有些培養基上有形成單一菌落，有些則沒有。失敗原因若是使用塗碟法就可能是菌液塗抹不夠均勻，造成一大團的菌液而不能分離出單一菌落；若是使用倒碟法就可能是將稀釋的菌液與培養基沒有搖動混合均勻，造成分離不佳；若是劃碟法可能是未能均勻將液體樣品劃於固體培養基表面上，造成分離不佳。 2.為何實驗須有對照組，其目的為何？若對照