水溶性C60在骨关节炎中抑制破骨细胞分化及侵蚀.pptVIP

Water-soluble fullerene (C60) inhibitsthe osteoclast differentiation and bonedestruction in arthritis 张鹏礼 2011年8月 摘要 氧自由基是破骨分化的RANK通路重要的信号分子，而具有清除自由基功能的水溶性C60，能够抑制RANK介导的破骨细胞形成和破骨性骨吸收，从而能够控制关节炎的发展。 风湿性关节炎 类风湿性关节炎（Rheumatoid arthritis ，RA) 是一种以关节滑膜炎为特征的慢性全身性自身免疫性疾病。滑膜炎持久反复发作，可导致关节内软骨和骨的破坏，关节功能障碍，甚至残废。 关节增生能够腐蚀和破坏RA患者骨和软骨。随着病情的进展，破骨细胞性骨吸收加速。 RA早期 RA晚期 风湿性关节炎 近期研究发现，RA的发病和骨免疫，骨代谢与免疫系统的相互作用密切相关。 破骨细胞从前体细胞的分化诱导是由receptor activator of NFκB (RANK)–RANK 配体 (RANKL) 信号介导的。 RANKL是由关节滑液的成纤维细胞、活化T细胞、巨噬细胞以及成骨细胞分泌的。 ROS 活性氧（reactive oxygen species ，ROS）在RANK-RANKL信号调控的破骨细胞分化中有重要作用。 靶作用于ROS能够成为治疗破骨细胞过度骨吸收的良好切入点。 RANKL-RANK C60能与氧自由基反应，是一种潜在的较强自由基清除剂。有报道显示:C60的抗氧化能力是其他抗氧化剂的上百倍。 C60的衍生物已经显示出很多生物学效应比如神经凋亡、促进软骨形成、保护紫外照射后皮肤角质细胞免受伤害等。这些证明C60能作为一系列由氧自由基诱导的病理过程的保护剂。 材料和方法 根据破骨细胞的两个特异性标记：能被TRAP染色的多核细胞是成熟破骨细胞，它能在象牙片上形成骨吸收陷窝，验证这些细胞为有功能破骨细胞。 材料和方法 C60对RANK介导的破骨细胞分化 体外实验 破骨前体细胞 密度5 × 10^4 培养基：α-MEM+10%胎牛血清+青霉素50IU/ml+链霉素50mg/ml+M-CSF33ng/ml 30ng/ml可溶性RANKL作为刺激因子。 培养7天后进行TRAP染色 分组：对照组，0.1, 1.0, or 10.0 μM组 材料和方法 C60对破骨细胞骨吸收的影响 破骨细胞的骨吸收能力可以在象牙片上进行检测。 96孔板 0.1, 1.0, or 10.0 μM C60 2周后进行苏木精染色 高分辨率显微镜VH-8000下观察骨陷窝。 image analysis system (Image Gauge version 4.0, Fuji Photo Film Co, Ltd, Tokyo, Japan)进行图像分析。 材料和方法 C60对关节炎动物模型的效应 8周龄大鼠模型 分组：对照组（n=20） C60处理组（n=20） 对照组：左踝关节内注射20.0 μL PBS，每周一次，共八周。 C60处理组:左踝关节内注射20.0 μL C60（10.0μM）每周一次，共八周。 有踝关节不做处理，以观察对对侧的影响。 材料和方法 四周和六周处死动物（n=4）,骨和软骨组织进行组织学分析。 VH-8000观察标本中多核破骨细胞数进行计数，每个标本随机选取6个不同的区域进行观察。 骨破坏分成四个等级： 0-正常 1-少部分皮质骨损失 2-中等量的皮质骨和小梁骨损失 3-明显的骨损失 结果和讨论 对模型大鼠的影响 结果和讨论 结论 本研究而发现：水溶性C60能抑制破骨细胞形成以及骨的过度吸收。关节炎模型大鼠关节内注射C60能抑制关节的骨破坏。C60可能作为关节炎患者的治疗药物。 心得 本实验设计较为简单，采用了体内和体外实验联合的实验设计，体外实验只测了2个简单的特征性的TRAP染色和象牙片的骨吸收，体内实验则采用动物模型进行实验。 体外实验用了3种C60浓度，可供参考； 动物实验选择最佳的抑制浓度进行实验； 体内体外的