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酶联免疫吸附试验 ELISA 免疫酶技术(enzyme immunoassay)： 是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。 就是利用酶标记抗体或抗原，以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。 酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent assay） 是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。 常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。 ELISA检测抗原 Ag + Ab* ? Ag-Ab* ELISA检测抗体 Ab + Ag* ? Ab-Ag* ELISA检测抗体 Ag + Ab1 ? Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ? Ag-Ab1-Ab2* 实验材料： 试剂盒 包被液CBS：PH9.6，0.05mol/L碳酸盐缓冲液 洗板液或稀释液：PH7.4，0.01mol/L PBS 底物溶液：OPD-H2O2 终止液：2mol/L H2S04 酶标反应板（一条/人） 实验方法 每人将标本原液作任意倍数稀释，终体积为100ul，作为样品。建议30-100倍之间 微孔反应板每人一条（8孔） 每孔加入待测标本50ul，Neg和Pos孔分别加入阴性对照和阳性对照试剂1滴。blank孔不加。 每孔加入酶结合物1滴（blank孔不加），充分混匀，封板，37℃孵育30分钟。（看光盘） 弃去孔内液体，用洗涤液注满各孔，静置5秒，甩干，重复5次后拍干。 每孔加显色剂A、B各1滴，充分混匀，封板，37℃孵育15分钟。 每孔加终止液1滴，混匀。 结果判定 用酶标仪读数，波长450nm COV：Cut-off Value参考值 NC：阴性对照平均OD值 COV=NC（阴性对照平均OD值）+0.100 S：待测样本OD值 S/COV值：待测样本和COV的比值 S/COV值≥1为阳性， S/COV值≤1为阴性 NC ≤ 0.01 PC ≥ 1 检测结果有效 注意事项 不要用手接触微孔板底面 用滴瓶垂直滴加液体 洗涤应充分，尽量拍干 混匀时切忌相互污染 思考题 在实际操作中，你认为有哪些因素可以影响定量检测的结果？（操作中应注意的问题） * * 固定OD值 Pos 样品 样品 1:2 样品 1:8 样品 1:16 样品 1:4 Neg blank *