化学生物学 第六章 化学物质与蛋白质的相互作用2.pptVIP

第六章 化学物质与蛋白质的相互作用 在蛋白质体外的应用中，一般涉及到分离纯化、储存、含量检测等过程，其中常常发生化学物质与蛋白质非专一性的相互作用，如沉淀作用、变性作用、稳定作用以及化学修饰作用等。 第一节 化学物质对蛋白质的沉淀作用 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型性质. 根据蛋白质的亲水胶体性质，当其环境发生改变时，蛋白质会发生沉淀作用。 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质。在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。 1.无机物沉淀 当向蛋白质溶液中逐渐加入无机盐时，开始，蛋白质的溶解增大，这是由于蛋白质的活度系数降低的缘故，这种现象称为盐溶。 但当继续加入电解质时，另一种因素起作用，使蛋白质的溶解度减小，称为盐析。这是由于电解质的离子在水中发生水化，当电解质的浓度增加时，水分子就离开蛋白质的周围，暴露出疏水区域，疏水区域间的相互作用，使蛋白质聚集而沉淀，疏水区域越多，就越易产生沉淀。 含高价阴离子的盐，效果比1价的盐好。阴离子的盐析效果有下列次序： 柠檬酸盐PO43-＞SO42-＞CH3COO-＞Cl-＞NO3-＞SCN-。 但高价阳离子的效果不如低价阳离子，例如硫酸镁的效果不如硫酸铵。对于1价阳离子则有下列次序：NH4+＞K+＞Na+。 （2）金属离子沉淀法 一些高价金属离子对沉淀蛋白质很有效。它们可以分为三类： 第一类为Mn2+，Fe2+，Co2+，Ni2+，Cu2+，Zn2+和Cd2+能和蛋白质分子表面的羧基，氨基、咪唑基、胍基等侧链结合。 第二类为Ca2+，Ba2+，Mg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的羧基结合，但不和含氮化合物相结合。 第三类为Ag+，Hg2+和Pb2+能和蛋白质分子表面的巯基相结合。 2.等电点沉淀 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 等电点沉淀法的一个主要优点是很多蛋白质的等电点都在偏酸性范围内，而无机酸通常价较廉，并且某些酸，如磷酸、盐酸和硫酸的应用能为蛋白质类食品所允许。同时，常可直接进行其他纯化操作，无需将残余的酸除去。 等电点沉淀法的最主要缺点是酸化时，易使蛋白质失活，这是由于蛋白质对低pH比较敏感。 pH对?-乳球蛋白溶解度的影响 3.有机物沉淀 当有机溶剂浓度增大时，水对蛋白质分子表面上荷电基团或亲水基团的水化程度降低，或者说溶剂的介电常数降低，因而静电吸力增大。 在疏水区域附近近有序排列的水分子可以为有机溶剂所取代，使这些区域的溶解性增大。但除了疏水性特别强的蛋白质外，对多数蛋白质来说，后者影响较小，所以总的效果是导致蛋白质分子聚集而沉淀。 有机溶剂沉淀法的优点是溶剂容易蒸发除去，不会残留在成品中，因此适用于制备食品蛋白质。而且有机溶剂密度低，与沉淀物密度差大，便于离心分离。有机溶剂沉淀法的缺点是容易使蛋白质变性失活，且有机溶剂易燃、易爆、安全要求较高。 一般所选择的溶剂必须能和水互溶，而和蛋白质不发生化学反应，最常用的溶剂是乙醇和丙酮，加量在20%-50%（V/V））之间。当蛋白质的溶液pH接近等电点时，引起沉淀所需加入有机溶剂的量较少。 （2）酚类化合物及有机酸沉淀 当蛋白质溶液pH小于其等电点时，蛋白质颗粒带有正电荷，容易与酚类化合物或有机酸酸根所带的负电荷发生作用生成不溶性盐而沉淀。 这类化合物包括鞣酸（又称单宁）、苦味酸（即2,4,6-三硝基苯酚）、三氯乙酸、磺酰水杨酸等。 4.聚合物沉淀 许多非离子型聚合物，包括聚乙二醇（PEG）可用来进行选择性沉淀以纯化蛋白质。聚合物的作用认为与有机溶剂相似，能降低水化度，使蛋白质沉淀。PEG是一种特别有用的沉淀剂，因为无毒，不可燃性且对大多数蛋白质有保护作用而被广泛使用。 一般PEG的分子量需大于4000，最常用的是6000和20000。所用的PEG浓度通常为20%. （2）聚电解质沉淀法 有一些离子型多糖化合物可应用于沉淀食品蛋白质。如羧甲基纤维素，海藻酸盐，果胶酸盐和卡拉胶等。它们的作用主要是静电引力。如羧甲基纤维素能在pH值低于等电点时使蛋白质沉淀。 一些阴离子聚合物，如聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸，以及一些阳离子聚合物如聚乙烯亚胺和以聚苯乙烯为骨架的季胺盐也曾用来沉淀乳清蛋白质。 第二节 化学物质对蛋白质的稳定作用 许多蛋白质在一般缓冲溶液中的稳定性相当低，某些酶蛋白溶液在37C?放置的半衰期仅几个小时。 这种稳定性降低的原因常常是某些物理或化学因素破坏了维持蛋白质结构的天然状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失，这种现象称为蛋白质的变性。 一、蛋白质不可逆失活的化学因素 强的无机酸碱及有机酸碱都可以改变