北京中检维康 食品中黄曲霉毒素分析过程(国标祥解).pptVIP

国标”食品中黄曲霉毒素的测定免疫亲和层析净化高效液相色谱法和荧光光度法”祥解 北京中检维康技术有限公司 王雄 高级工程师 中华人民共和国国家标准 GB/T 18979-2003 食品中黄曲霉毒素的测定 免疫亲和层析净化高效液相色谱法 和荧光光度法 2003-08-01实施 适用范围及检测限 本标准适用于玉米、花生及其制品（花生酱、花生仁、花生米）、大米、小麦、植物油脂、酱油、食醋等食品中黄曲霉毒素的测定。 免疫亲和层析净化-荧光光度法测定黄曲霉毒素B1B2G1G2总量检出限为1μg/kg，酱油样品中检出限为2.5μg/kg。使用B亲和柱可以测定黄曲霉毒素B1，HPLC法可以分别测定黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2。 分析原理 黄曲霉毒素是天然存在的霉菌衍生代谢产生的一种毒素，已经被证明是1类致癌物，对人体容易产生癌症。黄曲霉毒素能够使牲畜产生疾病，降低生育率，所以会产生巨大的经济损失。 将试样经过甲醇-水提取，提取液经过滤、稀释后，滤液经过含有黄曲霉毒素特异抗体的免疫亲和柱层析净化，此抗体对黄曲霉毒素B1B2G1G2具有专一性，黄曲霉毒素交联在层析介质中的抗体上。用水将免疫亲和柱上杂质除去，以甲醇通过免疫亲和层析柱洗脱，加入溴溶液衍生，以提高测定灵敏度。洗脱液通过荧光光度计测定黄曲霉毒素（B1B2G1G2）总量。 操作步骤 样品的提取：研磨、称重样品；将样品与盐/甲醇/水混匀；过滤。 稀释、过滤：用水将上步的部分滤液稀释；过滤。 亲和柱色谱操作：将上步的滤液通过亲和柱；用水清洗亲和柱；用甲醇将黄曲霉毒素从亲和柱上淋洗下来，并收集于测试管中。 黄曲霉毒素的测定：将显色液加入到上步的淋洗液中，混匀；将测试管放入荧光计中，一分钟后读数。 荧光计的标定 标定值的设置：使用VICAM真菌标定标准物 无毒标定物的选择 选择无毒标定物检测黄曲霉毒素国际上仅维康一家。 采用二水硫酸喹啉+硫酸进行配兑，硫酸喹啉天然的荧光性质比较稳定。 为什么用户自己配兑的经常不适用：试剂纯度不够，各种荧光计的参数（激发光强度、光程、样品池等） 显色液的制备 量取5.0ml黄曲霉毒素的高浓度显色剂，置于50ml的显色液分配瓶中。 加入45.0ml纯水，混匀。 将分配瓶的瓶盖拧紧，不使用时，一定要将稀释的显色液瓶盖好，不要使用超过了8小时的稀释液。 以1：9的比例也可以配制不同体积的工作显色液。 试剂空白的测定 1纯水、甲醇、显色液的空白值保证为0。 2这几种试剂均在亲和柱分离、荧光计定量分析中使用，所以对测定结果具有很大的影响。 3保证为0，计算时更加简单，直接读数。 大米、玉米、小麦、花生及其制品样品的称量与提取 称取25克样品，5克氯化钠；置于搅拌杯中。 加入125毫升（7：3）甲醇/水溶液 植物油脂样品的称取 植物油脂：准确称取试样25.0g于250mL具塞锥形瓶中，加入5.0g氯化钠及加入甲醇-水（7+3）至125.0mL。 酱油样品的称取 酱油：称取试样50.0g于250.0mL具塞锥形瓶中，加入2.5g氯化钠及加入甲醇-水（8+2）至100.0mL。 食醋样品的称取与前处理 食醋：准确称取5.0g样品，加入1.0g氯化钠，以pH7.0磷酸盐缓冲溶液稀释至25.0mL，混匀，定量滤纸过滤。取10.0mL滤液加入10.0mL缓冲液，混匀。以玻璃纤维滤纸过滤1~2 次，至滤液澄清，备用。 提取液的选择 黄曲霉毒素在甲醇中具有较强的溶解性。可以保证黄曲霉毒素高的回收率。 甲醇+纯水（80+20，70+30，60+40）。 样品基质越复杂，甲醇的浓度越大，可以保证提取效率。 使用的提取液不同，后步稀释的倍数也不同。 为什么要加盐和缓冲液 抗体在一定强度的电解质、室温和中性的酸碱条件下具有理想的活性。同样，抗体与抗原的反应只有在这个条件才能得以进行。 均质样品 盖上搅拌杯的盖子，高速均质1-2 分钟。 也可以置于锥形瓶中，在摇床上振动30分钟左右。 粗滤与稀释 将均质液通过槽纹滤纸过滤，准确移取15毫升滤液并加入30毫升水稀释。 为什么要进行稀释 甲醇的浓度超过20%时，会使抗体变性，影响抗体的活性，另外也会增加对黄曲霉毒素的溶解能力。最终的结果是黄曲霉毒素的回收率会降低。所以，样品上柱之前必需将甲醇的浓度调整到小于20%。清洗杂质时的清洗液中的甲醇浓度也要小于20%。 细滤 将免疫亲和柱连接于玻璃注射器下，准确移取15毫升样品提取液注入玻璃注射器中。 样品过柱 将空气压力泵与玻璃注射器连接，调节压力使溶液以约6ml/min流速缓慢通过免疫亲