一常用的微生物分离纯化方法菌种分离纯化的方法有稀释混合倒.PDFVIP

(一) 常用的微生物分离纯化方法 菌种分离纯化的方法有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法、平板划线分离法、稀 释摇管法、液体培养基分离法、单细胞分离法、选择培养分离法等。其中前三种方法最为常 用,不需要特殊的仪器设备, 分离纯化效果好, 现分别简述如下  1. 稀释混合倒平板法 平板是指经熔化的固体培养基倒入无菌培养皿中, 冷却凝固而成的盛有固体培养基的 平皿。 该法是先将待分离的含菌样品, 用无菌生理盐水作一系列的稀释(常用十倍稀释法, 稀 释倍数要适当), 然后分别取不同稀释液少许  (0.5­1.0ml)于无菌培养皿中, 倾入已熔化并冷 却至 50℃左右的琼脂培养基, 迅速旋摇, 充分混匀。待琼脂凝固后,  即成为可能含菌的琼脂 平板。 于恒温箱中倒置培养一定时间后, 在琼脂平板表面或培养基中即可出现分散的单个菌 落。每个菌落可能是由一个细胞繁殖形成的。挑取单一个菌落, 一般再重复该法 1­2 次, 结 合显微镜检测个体形态特征,便可得到真正的纯培养物。若样品稀释时能充分混匀,取样量和 稀释倍数准确,则该法还可用于活菌数测定。 图 4  混合倒平板操作法示意图 图5 涂布平板操作法示意图  2.  稀释涂布平板法 采用上述稀释混合倒平板法有两个缺点， 一是会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间,  缺乏溶氧而生长受影响,形成的菌落微小难于挑取；一是在倾入熔化琼脂培养基时，若温度 控制过高,易烫死某些热敏感菌，过低则会引起琼脂太快凝固, 不能充分混匀。 在微生物学研究中, 更常用的纯种分离方法是稀释涂布平板法。该法是将已熔化并冷 却至约 50℃(减少冷凝水)的琼脂培养基, 先倒入无菌培养皿中, 制成无菌平板。待充分冷却 凝固后,将一定量(约 0.1 ml)的某一稀释度的样品悬液滴加在平板表面, 再用三角形无菌玻璃 涂棒涂布,使菌液均匀分散在整个平板表面, 倒置温箱培养后挑取单个菌落。 另一种简单快速有效的涂布平板法, 可省去含菌样品悬液的稀释, 直接吸取经振荡分 散的样品悬浮液 l 滴加入 1 号琼脂平板上, 用一支三角形无菌玻璃涂棒均匀涂布, 用此涂棒 再连续涂布 2 号、3  号、4  号平板(连续涂布起逐渐稀释作用， 涂布平板数视样品浓度而定), 翻 转此涂棒再涂布 5 号、6 号平板, 经适温倒置培养后挑取单个菌落。该法可称之为玻璃涂棒 连续涂布分离法。  3. 平板划线分离法 先倒制无菌琼脂培养基平板,待充分冷却凝固后,用接种环以无菌沾取少量待分离的含菌 样品,在无菌琼脂平板表面进行有规则的划线。划线的方式有连续划线、平行划线、扇形划 线或其它形式的划线。通过这样在平板上进行划线稀释, 微生物细胞数量将随着划线次数的 增加而减少, 并逐步分散开来。 经培养后,可在平板表面形成分散的单个菌落。但单个菌落并 不一定是由单个细胞形成的，需再重复划线 1­2 次, 并结合显微镜检测个体形态特征, 才可 获得真正的纯培养物。该法的特点是简便快速。 图6 平板划线分离操作法示意图 个体细胞的生长难以测定, 而且生长与繁殖是交替进行的,  因此，微生物的生长繁殖一 般不是依据个体细胞的大小, 而是以群体细胞数 目的增加作为指标的。测定微生物细胞数量 的方法很多, 主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法、光电比浊法、最大可能数(MPN)  法、膜过滤法等。 测定酵母细胞数或霉菌孢子数常采用在显微镜下直接进行计数的方法, 该计数方法被 广泛应用于酒精、啤酒和白酒等的工业化生产中。 平板菌落计数法被广泛应用于食品、饮品、水质和活菌制剂等的含菌指数或污染程度 的检测。该计数方法又称平板活菌计数法, 其最大优点是可以获得活菌数的信息。但是, 该 计数法操作过程较繁, 需要培养一定时间才有结果, 且测定结果易受多种因素的影响。 光电比浊计数法是采用光电比色计或分光光度计, 测定菌悬液的光密度或透光度, 其 优点是简便迅速, 可以连续测定, 适合于自动控制。但该法除了受菌体浓度影响外, 还受细 胞形态、大小、培养液成分及所采用光波长等因索的影响。  (一)显微镜直接计数法 该法是将酵母菌或霉菌孢子悬液, 放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在 显微镜下直接进行计数，是一种常用的微生物计数方法。 Thoma血球计数板是一