生物制药技术（二）.pptVIP

将外源基因通过体外重组后而导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。 (1) 产生5-粘性末端 一般分为5个步骤，包括预处理、固液分离、浓缩、纯化和产品定型。 （1）技术条件要温和 （2）选择性要好 （3）收率要高 （4）两个技术之间要能直接衔接 （5）整个分离纯化过程要快 2、目的产物的分离纯化 主要依赖色谱分离方法。色谱技术分为离子交换色谱、疏水色谱、反相色谱。亲和色谱、凝胶色谱、高压液相色谱等。 蛋白质纯化方法的设计通常是根据产物分子的物理、化学参数和生物学特性进行的。 选择纯化方法应根据目的蛋白质和杂蛋白的物理、化学和生物学方面性质的差异，尤其重要的是表面性质的差异。 （1）离子交换色谱（ion exchange chromatography,IEC）基本原理是通过带电的溶质分分子与离子交换剂中可交换的离子进行交换，从而达到分离的目的。 （2）反相色谱（reversed phase chromatography,RPC）和疏水色谱（hydrophobic interaction chromatography,HIC） 反相色谱和疏水色谱是根据蛋白质疏水性的差异来分离纯化的。 （3）亲和色谱（ affinity chromatography,AC） 亲和色谱是利用固定化配基与目的蛋白质之间特异的生物亲和力进行吸附的 。亲和色谱的过程大致分为3步：第一步配基固定化;第二步吸附目的产物；第三步样品解吸。 （4）凝胶过滤色谱 凝胶过滤是以具有空隙大小一定的多孔性凝胶作为分离介质，小分子能进入孔内，在柱中缓慢移动，而大分子不能进入孔内，快速移动，利用这种移动差别可使大分子与小分子分开。 3、非蛋白质类杂质的去除 非蛋白质类杂质不应忽视，在纯化过程中，需特别注意3种可能存在的非蛋白类杂质，它们是DNA、热原质和病毒。 （1）DNA的去除 （2）热原质的去除 （3）病毒的去除 1、根据产物表达形式来选择 2、根据分离单元之间的衔接选择 3、根据分离纯化工艺的要求来选择 当此插入外源DNA的重组质粒载体转化宿主菌并在药物选择平板上培养时，根据对该药物由抗性转变为敏感，便可筛选出重组转化子。 lacZ Am N2H ?片段 COOH ?片段 2、β-半乳糖核苷酶基因插入失活法 （LacZ基因 N端序列） 插入片段 （LacZ基因失活） LacZ基因 C端序列 LacZ酶 这一区段编码β-半乳糖苷酶N端的一个片段，而宿主细胞可编码β-半乳糖核苷酶C端部分片段，两者之间可以实现基因内互补（称为α互补），从而融为一体，形成具有酶学活力的蛋白质。 许多载体带有一个来自大肠杆菌的Lac操纵子DNA区段，其中含有β-半乳糖核苷酶基因（LacZ）的编码信息。 蓝白筛选原理： 由α互补而产生的 Lac+ 细菌在有诱导物IPTG和生色底物X-gal存在下形成蓝色菌落。 然而，当外源DNA片段插入到质粒的多克隆位点后，使LacZ的N端片段失活，破坏了α互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。 3、放射性标记核酸探针杂交筛选法 探针(probe)： 带有标记的一小段已知序列的RNA或DNA片段。 核酸分子杂交 用和所要筛选的DNA互补的探针退火杂交，根据探针上的标记筛选到阳性菌，即带有目的DNA片段的菌。 原位杂交： 将菌落或噬菌斑原位转移或影印到硝酸纤维素滤膜上→裂解菌落或噬菌体并使释放的DNA原位结合于滤膜上→ 固定于滤膜上的细菌DNA或噬菌体DNA与标记探针进行杂交 （2）不要求插入的外源基因表达， 只要求提供合适的探针，就能用于测定 任何插入顺序。 核酸分子杂交优点： （1）具有高度的特异性和敏感性。 （二）重组体的鉴定： 1、凝胶电泳鉴定法： 有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳两种。 DNA分子在电场中向阳性移动，不同长度的DNA片段会表现出不同的迁移率，因而就可根据DNA分子的大小使其分离。 利用末端转移酶可催化dNTP加到单链或双链DNA 3′-OH能力，在目的DNA和质粒载体上加入互补同聚物，制造出粘性末端，再进行粘端连接。 。 5、同聚物加尾法 5′ 3′ 3′ 5′ 载体DNA 5′ 3′ 3′ 5′ 目的基因 限制酶或机械剪切 限制酶 5′ 3′ ′ 5′ ′ T(T)nT T(T)nT 5′ 5′ 3′ 3′ 5′ 5′ 3′ A(A)nA A(A)nA3′ 5′ λ-核酸外