10第十章基因治疗.pptVIP

基因治疗的两条途径 AAV的特点 **以潜伏感染为主； **病毒基因组与细胞共存； **只要宿主细胞正常，AAV基因表达就处于抑制而维持潜伏状态； **若细胞受刺激，表达应激基因，AAV基因表达从而使AAV病毒复制； **产生子代病毒并释放，又感染新的细胞 第1个基因治疗死亡的病例 1999年9月17日 美国宾夕法尼亚大学吉姆.威尔逊教授基因治疗“尿素循环障碍”病 病人：Jesse，男，18岁， 患鸟氨酸氨基甲酰转移酶 不足症的罕见遗传性疾病，先天性尿素循环障碍 治疗方案： 1、鸟氨酸转氨甲酰酶基因与腺病毒DNA重组 2、38万亿携带鸟氨酸转氨甲酰酶基因的腺病毒 注入Jesse肝脏 Jesse病情恶化：高热40oC,血氨含量升高，肝性脑病，肺功能衰竭，第4天死亡。 第五节 基因治疗目前存在的问题 （一）安全性 1、感染 2、有益基因的丢失 3、诱发癌变 （二）稳定性 1、基因转录系统不稳定 2、形成不正确的信息RNA 3、基因表达的控制因素复杂 4、靶细胞死亡 （三）免疫性 （四）伦理问题 受体介导转移技术示意图 脂质体介导的基因转移示意图 3）脂质体-DNA复合物法： 脂质体是由脂质双层分子组成的环形封闭囊泡，无毒、无免疫原性，DNA被包裹于中。这种脂质体外壳可使DNA保持完整，通过一种内吞噬过程进入细胞。 （二） 病毒介导的基因转移 该类方法是以病毒为载体，将目的基因导入 靶细胞或器官，并使之表达。 使用的病毒载体： ***经过改建的有复制缺陷的病毒。 （缺失了其自身复制所必需的一些基因） ***插入了治疗性基因、一些基因的调控成份 (如启动子和增强子)。 目前在基因转移中所使用的病毒主要有以下几类。 1）逆转录病毒（Retrovirus，RV）载体 RV是小的单股RNA病毒，是目前基因转移中应用 最为广泛的一类病毒。 逆转录病毒转染效率高，理论上可高达100%。 转染后，前病毒基因组(经逆转录后形成的DNA) 可与靶细胞基因组随机整合，因而能较稳定地表 达外源基因。 ** 只能转染处于增殖状态的细胞，对静止期细胞无效。 ** 所携带的外源基因不能太大，否则会影响病毒的效 价和稳定性。 ** 理论上讲，从包装细胞释放出来的复制缺陷的逆转录 病毒，只能一次性感染靶细胞，不会扩散到其它细胞。 但在某种情况下，也会造成野生型病毒的爆发。 ** 由于病毒的基因组是随机整合到靶细胞基因组的， 因而具有致细胞癌变的可能。 ** 逆转录病毒不能耐受纯化和浓缩等处理过程，否则会 使其感染活性大大下降。 该类载体也有一定的缺陷，表现在： 2）腺病毒（Adenovirus, AV ）载体 AV是一些大的（约38kb）的双链DNA病毒。 它通过受体介导的内吞作用进入细胞内，然后腺 病毒基因组转移至细胞核内，保持在染色体外， 不整合进入宿主细胞基因组中。 腺病毒是人类呼吸道感染的病原体，宿主细胞范围广，可感染分裂和非分裂终末分化细胞，如神经元等。 腺病毒的优点 **基因导入效率高，对人类安全； **宿主范围广； **基因转导与细胞分裂无关； **重组腺病毒可通过口服经肠道吸收、或喷雾吸入或气管内滴注； **腺病毒载体容量较大，可插入7.5 kb外源基因； 3）腺相关病毒（Adeno-associated virus，AAV）载体 AAV 属于微小病毒家族成员，是一类小的单链 DNA病毒（基因组约4.7kb），非常稳定。本身无致病 性，需辅助病毒(常为AV)存在时才能复制。AAV可感 染人的细胞，并能整合至非分裂相细胞。大部分AAV 基因组可去除，从而可使外源基因得以大量补足。 AAV Virus Particles （ 四）外源基因表达的筛检 在体外培养细胞中，基因转化效率很难达到100%， 故需利用载体中的标记基因对转化细胞进行筛选。 在较多的表达载体中都有neor标记基因的存在，若向培养基中加入药物G418，未被转化的细胞则因不存在neor标记基因而不能存活，最后只有转化细胞存活下来。 在筛选出转化细胞后仍需检测转化细胞中外源基因的表达状况。只有稳