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生物化学与分子生物学实验技术 Experimental technology of Biochemistry and molecular biology 成绩分布： 理论考试（60分） 实验成绩（40分） The basic experimental technology： 一、分光光度技术 二、层析技术 三、电泳技术 四、离心分析技术 五、PCR技术 六、蛋白分离和纯化技术 ??一、分光光度技术 (Spectrophotometry) Contents： 一) 光的概述 二) 分光光度法的概念及原理 三) 分光光度计的构造 四) 722型分光光度计的使用方法 五) 测定物含量的计算 一) 光的概述（lightwave） 波长：一个“完整的波” 的距离。 电磁波谱范围表： 不同波长 (或不同频率)的电磁波在相同介质中的传播速度都相同。 电磁波谱范围表： 紫外光：10-400nm 可见光：400～760nm 红外光：760-5000000nm 二) 分光光度法的概念及原理 1. 分光光度法的概念 当光线通过透明溶液介质时，其辐射能量有部分被吸收而部分被透过，所以光线射出溶液介质后光能被减少。这种利用光能的吸收和透过比例来进行某些物质的定性定量分析。 入射光 I0 ? 吸收Ia ?透射It I0= Ia+ It+ Ir I0= Ia+ It 透光率(transmittance) T = It/ I0 吸光度(absorbance) 2. Lambert-Beer定律 三) 分光光度计的构造 能从含有各种波长的混合光中将每一单色光分离出来并测量其强度的仪器称为分光光度计。 1.光源 ：要求能提供所需波长范围的连续光谱，（钨灯、氢灯）通常用6～12 V钨丝灯作可见光区的光源，发出的连续光谱在360—800nm范围内。 2.单色器： 单色器的作用是将光源发出的连续光谱（复合光）分解为单色光的装置。 3.比色皿：也称吸收池 用于盛放溶液的容器。它是由无色透明、耐腐蚀、化学性质相同、厚度相等的玻璃或石英制成的，按其厚度分为0.5 cm，1 cm，2 cm，3 cm和5 cm。 4. 检测器：检测器的作用是接受从比色皿发出的透射光并转换成电信号进行测量。 光电管是一个真空或充有少量惰性气体的二极管。光电管装有一个阴极和一个阳极。 5. 显示装置：显示装置的作用是把放大的信号以吸光度A或透光率T的方式显示或记录下来。 四) 722型分光光度计的使用方法 722型（触摸键式） 722型（旋钮式） 722型（触摸键式） 1. 开电，预热20分钟； 2. 调“λ”——选择所需波长 3. 装液（2/3） 722型（触摸键式） 1. 开电，预热20分钟； 2. 调“λ”——选择所需波长 3. 装液（2/3） 4. 功能键置“T”——调“T”为0（遮光体对准光缝） 722型（触摸键式） 1. 开电，预热20分钟； 2. 调“λ”——选择所需波长 3. 装液（2/3） 4. 功能键置“T”——调“T”为0（遮光体对准光缝） 5. 功能键置“T”——调“T”为100（空白管对准光缝） 6.功能键置“A”——依次拉动拉杆（听到“咔”一声）比色、读数并记录（A值取三位有效数值） 7. 洗涤比色皿 722型（旋钮式） 1. 开电，预热20分钟； 2. 调“λ”——选择所需波长 3. 装液（2/3） 4. 功能选择扭置T，调“T”为0（开盖），调“T”为100（关盖且空白管对准光缝） 5. 功能选择扭置A（为0时方可测定读数） 6.依次拉动拉杆（听到“咔”一声） 比色、读数并记录（A值取三位有效数值） 7. 洗涤比色皿 722分光光度计使用注意事项： 1.样品室盖应轻开轻放； 2.比色皿拿磨砂面，液体装入约2/3高度，并用擦镜纸擦净外壁，每次用完后自来水冲洗干净，倒置于滤纸上； 3.倒取试剂时不能在仪器表面上方操作，仪器上请勿放任何物品； 五）测定物含量的计算 标准管法 标准曲线法 1. 标准管法 1. 标准管法 2. 标准曲线法 Contents: 一) 层析技术的概念 二) 层析技术的原理 三) 层析技术的分类 四) 凝胶层析技术 （1）按两相所处的状态分类： 高效液相色谱法与气相色谱法的比较 目前高效液相色谱法已被广泛应用于分析对生物学和医药上有重大意义的大分子物质，例如蛋白质、核酸、氨基酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料及药物等物质的分离和分析。 高效液相