2-2土壤中分解尿素的细菌的分离和计数（第二课时）.ppt

实验设计 土壤中分解尿素的细菌的分离与记数 1.土壤取样 2.制备培养基 3.样品稀释、取样涂布 4.微生物的培养、观察并记录结果 5.细菌的计数 土壤中分解尿素的细菌的分离与计数 　从肥沃、湿润的土壤中取样。先铲去表层土3cm左右，再取样，将样品装入事先准备好的信封中。 实验步骤 1．土壤取样 制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。　 实验步骤 2.制备培养基 制备5个牛肉膏蛋白胨培养基和15个选择培养基，准备好无菌试管和移液管。 注：每个稀释度下需要3个选择培养基（平行重复原则），1个牛肉膏蛋白胨培养基。选用稀释倍数为103~107的稀释液。　　 实验步骤 2.制备培养基 　　为什么分离不同的微生物要采用不同的稀释度？测定土壤中细菌的总量和测定土壤中能分解尿素的细菌的数量，选用的稀释范围相同吗？ 　　 因为土壤中各类微生物的数量(单位：株/kg)是不同的，例如在干旱土壤中的上层样本中：好氧及兼性厌氧细菌数约为2 185万，放线菌数约为477万，霉菌数约为23.1万。因此，为获得不同类型的微生物，就需要按不同的稀释度进行分离，同时还应当有针对性地提供选择培养的条件。 　　测定土壤中细菌的数量，一般选用104、105和106倍的稀释液进行平板培养；测定放线菌的数量，一般选用103、104和105倍稀释液；测定真菌的数量，一般选用102、103和104倍稀释液。 注： 样品的稀释 将10g土样加入盛有90mL无菌水的锥形瓶中,充分摇匀，吸取上清液1mL，转移至盛有9mL水的无菌试管中，依次等比稀释至107稀释度，并按照由107至103稀释度的顺序分别吸取0.1mL进行平板涂布操作。按照浓度从低到高的顺序涂布平板，不必更换移液管。　 实验步骤 3.样品稀释、取样涂布 注意：由于初次实验，对于稀释的范围没有把握，因此选择了一个较为宽泛的范围：稀释倍数为103～107。 　　将涂布好的培养皿放在30℃下培养。比较牛肉膏培养基和选择培养基中菌落的数量、形态等，并做好记录。 　　 4.微生物的培养、观察并记录结果 　　不同种类的微生物，往往需要不同的培养温度和培养时间。细菌一般在30~37℃的温度下培养1~2d；放线菌一般在25~28℃的温度下培养5~7d；而霉菌一般在25~28℃的温度下培养3~4d。 注： 　　一般来说，在一定的培养条件下(相同的培养基、温度及培养时间)，同种微生物表现出稳定的菌落特征。菌落形状、大小、隆起程度和颜色 当菌落数目稳定时，选取菌落数在30~300的平板进行计数。在同一稀释度下，至少对3个平板进行重复计数，然后求出平均值，并根据平板所对应的稀释度计算出样品中细菌的数目。　 实验步骤 5.细菌的计数 [一]无菌操作 1、取土用的小铁铲的盛土样的信封在使用前都需要灭菌。 2、应在火焰旁称取土壤。在火焰附近将称好的土样倒入锥形瓶中，塞好棉塞。 3、在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁操作。 [二]做好标记 注明培养基种类、培养日期、平板培养样品的稀释度等。 [三]规划时间 挑选选择培养基中不同形态的菌落接入含酚红培养基 的斜面中，观察能否变红。 1、结合对照，分析培养物中是否有杂菌污染以及选择培养基是否筛选出一些菌落。 2、是否获得了某一稀释度下，菌落数目在30——300的平板。在这稀释度下，是否至少有两个平板的菌落数相近？ 3、你统计的每克土壤中含有能分解尿素的细菌的菌落数是多少？与其他同学的结果接近吗？如果差异很大，可能是什么原因引起的？