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酶联免疫吸附试验（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays, ELISA） ;免疫学三大标记技术; ELISA 的发展历程;酶联免疫吸附试验（ELISA）;ELISA反应类型;1.将抗体包被在固相载体上。 2.如样品中含有抗原，则结合为抗原抗体复合物。 3.再加入以辣根过氧化物酶标记的已知抗体，使之与抗原结合，形成抗 体-抗原-酶标记抗体复合物。 4.标记的酶可催化底物（四甲基联苯胺）起显色反应，指示特异性抗原 抗体反应的存在。在一定范围内显色深浅与抗原量成正比 ;双抗体夹心法;;桥联法（ABC－ELISA）：;操作步骤 1、装板条（勿摸孔底、注意方向） 2、加抗原（勿刮孔底、勿打出太多气泡） 3、孵育 37℃ 30min（全班同步） 4、甩去孔内液体， 洗涤3次：洗涤液加满、略震晃、甩去、拍干 （注意团队合作） 5、加抗体，每孔100ul 6、孵育 37℃ 30min（全班同步） 7、重复第4步，但洗4次 8、加底物A和B各100ul，略震晃混匀 9、孵育 37℃ （全班同步）10min左右，待色变蓝 10、加终止液50ul，略震晃混匀 11、酶标仪测OD 12、画标准曲线，确定样本浓度;;操作注意事项;ELISA技术要点 ;ELISA技术要点;免疫吸附剂： 固相的抗原或抗体称为免疫吸附剂。将抗原或抗体固相化的过程称为包被（Coating）。 若包被的蛋白浓度过低，在包被后再用1%~5%牛血清白蛋白包被一次，以消除非特异性显色的干扰，这一过程称为封闭。;酶和底物： 酶：要求纯度高、催化反应的转化率高、专一性强、性质稳定、来源丰富、价格低廉。制备的酶标抗体或抗原性质稳定，保持活性和催化能力。 常用的酶：辣根过氧化物酶（HRP） 碱性磷酸（AP） 对应于HRP的底物：邻苯二胺（OPD）四甲基联苯胺（TMB） 对应于AP的底物一般采用对硝基苯磷酸酯（p-NPP）。产物为黄色的对硝基酚，用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一段时间 OPD：灵敏度高，比色方便。缺点是应用液稳定性差，具有致异变性。 TMB：经酶作用后由无色变蓝色，对比鲜明。加酸中止后变黄色，可用于定量。稳定性好，无致异变性。 ;酶与抗原或抗体的结合 戊二醛交联法 过碘酸氧化法 ;Add HRP labeled antibody;型号：ThermoLabsystems Multiskan MK3 将酶标仪后部的电??开关打开，仪器将显示自检、基础酶联、软件版本号，随后显示“基础酶联”、“准备！”和具体时间。开机显示主界面后，预热5分钟。 按“调出”键，再按“4”、“输入”键，选择程序4进行测量。（单波长450nm检测、每板第1列为空白） 将96孔酶标板置于酶标板架，（48孔酶标板用黑色配件遮住另外48孔）确认稳固。 按“开始”键，显示“正在读数”，打印机自行打印结果，每组根据数据在半对数坐标纸上画出标准曲线，并得到标本的含量。 再按“开始”键，对下一块酶标板进行数据检测。;半对数坐标纸; ELISA的各种方法中，包被、酶标记和被检测的分别是什么？ ELISA实验过程应注意些什么？使结果可靠有可比性。;