必威体育精装版细菌内毒素检查法与实验分析.docVIP

学习交流题目： 细菌内毒素检查法与实验分析 莫水晶（高级工程师） 热原与细菌内毒素的研究进展 （一）热原与热原反应 一百多年前，在西方医药学的发展史上，一个重要的发展就是注射给药（特别是静脉注射）方式的创立，rrdon-Sanderson）从腐肉中分离出不带活菌的物质，能引起上述一系列症状，并称之为热原（Pyrogen）。eibert肯定热原来源于细菌，它能从滤器滤过，对热稳定，注射剂虽经严格灭菌，仍不能排除热原反应的发生，而提出采用家兔检测热原的方法。 1、热原检查法的建立及优、缺点 1942年美国首先将家兔热原检查方法收入药典，作为检查药品注射液中发热物质的法定方法。因此，相继在世界各国药典均规定了这一检查方法。中国药典自1953年版开始收载了热原检查法（各国药典方法基本相同）。近半个世纪以来，这项保障药品安全的检查，发挥了重要作用。 家兔热原检查法的优点：它能反映出“热原”引起哺乳动物复杂的升温反应过程，除此之外很难列出这一检查方法的更多优点。 1952年，世界卫生组织生物标准化专家委员会，邀请了一些国家协作，试图建立热原标准品，使这一检查方法成为一种定量的方法。但实验结果表明，热原质的剂量与家兔升温反应关系的直线斜率是不一样的，有的很锐，有的很平，使热原检查方法成为一种定量方法的任何努力都失败了。而且随着科学技术和制药工业的发展，这一检查方法的局限性，首先是这一方法不能标准化。 缺点：热原检查法之所以不能进行定量测定原因是： （1）、热原的绝对不均一性（不同细菌来源的不一致性），不知道被检测品中存在热原到底是哪一种，因此无法确定选择从哪一种细菌制备的热原作为一个“标准品” （2）、家兔经常处于被革兰氏细菌污染的环境中，通过吸入、食入、皮肤受伤，感染了这些细菌，可以说每个家兔生活中已经或多或少地被革兰氏细菌免疫了。 （3）、家兔试验，常常处于被惊扰的条件下，惊扰可能引起降温或升温。 （4）、这一方法的精密度和灵敏度均很差，试验的重复性差，特别是对于边缘产品，主要原因是动物个体之间对热原反应性的差异，灵敏度差也是一个原因。目前美国、欧洲药典都拒绝以这一试验控制水的热原检查。 (5)、成本高。 2、热原致热机理 多年来的研究已经证明，热原进入人体血液循环系统后，并不直接引起发热和其它毒性反应，但它可使白细胞（单核细胞）释放出“内源性热原”质，这种内源性热原质是热原和炎症活性的细胞变动素（Cytokines）混合物，白细胞介素与肿瘤坏死因子a；白细胞介素和干扰素等。 自1988年英国学者Poole.S报道用放射免疫方法测定细胞变动素后，在欧洲药学界引起重视，它很有可能导致建立一种新型的热原检查方法。因此作为检测微量细菌内毒素的鲎试验（Limulns test）的创立，除了在临床上用于检测内毒素血症外，一个重要的研究领域就是如何评价它在药品热原检查方面的地位以及它与经典的药品热原检查法的关系。 （二）细菌内毒素 在自然界，细菌属微生物中原核生物，根据细菌对革兰氏染色法的反应，可分为革兰阳性菌和革兰氏阴性菌，这种区别主要是与细胞壁的结构性质有关。 这种毒素可归纳为两类：一类称外毒素（Exotoxin），它是细菌的代谢产物，大多数革兰氏阳性菌在生长繁殖的过程中，经常不断地向菌体外分泌这些毒素，一旦细菌死亡、解体，毒素也不再产生，这些毒素的主要成份是复合蛋白，对光、热、酸、碱都很不稳定。 另一类称内毒素（Endotoxin），它是革兰氏阴性菌的细胞壁外壁层上的特有结构，革兰氏阳性菌则无，它在细菌生长、繁殖过程中，并不分泌到介质中，也不能从外壁层上自然脱落，它不是细菌的代谢产物，当细菌死亡解体后，才显示出一系列的内毒素生物活性。 1、细菌内毒素化学组成 细菌内毒素（Endotoxin）是G-菌细胞壁层上的特有结构，内毒素为外源性致热原，它可激活性粒细胞，使之释放出一种内源性热原质，作用于体温调节中枢，引起发热。 到目前为止，我们知道细菌内毒素作为G-菌细胞壁外表层结构的一部分脂多糖主要是由多糖O抗原，核心多糖和类脂A三部分组成。类脂A位于最外层。多糖抗原向外由若干个低聚糖的重复单位组成的多糖链，具有特异性，核心多糖分为内核心及外核心，外核心由数种单糖，包括葡萄糖、半乳糖、乙酰氨基葡萄糖等组成。内核心含有庚糖及特殊的KDO（3-脱氧-D-甘露糖-辛酮糖）。KDO以耐酸的酮糖键与类脂A的氨基葡萄糖连接。所有G-菌都有此结构。类脂A是以脂化的葡萄糖胺二糖为单位，通过焦磷酸键组成的一种独特的糖脂化合物，具有致热作用，是革兰氏阴性细菌内毒素的毒性成分。 ·脂多糖结构 ·类脂A结构 2、细菌内毒素的生物活性 （1）、致热性 （2）、致死毒性 （3）、白细胞减少 （4）、降低血压、休克 （5）、激活凝血系统 （6）、诱导对内毒素的耐受性 （7）、鲎