裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在DHA合成途径研究中的应用汇总.pdf

DI{A0＆琏径M究中∞n月 ※睛壶苗遗传转№体系Il勺Ⅻ究Ⅱ#n 裂殖壶菌遗传转化体系的研究及其在DHA合成途径研究中 的应用 摘要 acid，DHA)是一种极其重要的∞一3系列 一I一碳?i烯酸(docosahexaenoic 小饱和脂肪酸，具有抗心血管病、抗癌、降血脂、促进智力发育和保护视力等重 有重要的经济价值而备受关注。对裂殖壶菌DHA合成途径的研究将对提高裂殖 壶茁的DHA含量有重要意义，因此本论文针对裂殖壶苗18SrDNA序列分析、 遗传转化体系研究．克隆DHA合成相关基因并进行基因缺失等方面开展工作， 为研究裂殖壶菌的DHA合成途径奠定基础。 株经紫外诱变筛选的10个菌株中扩增出18SrDNA基因序列(序列长度为 rDNA序列比对分析。结果表明，s 175lbp．1758bp)，与GenBank中的18S FJLI一512 5D 在96％以上：与同属异种的置mangrovei(GenBankNoDQl00293)只有93％的 同源性。并通过计算遗传距离及构建系统进化树．结果显示种内诱变产生的细微 8S 变异小于同届内不同物种之间的变异，表明1 rDNA序列鉴定可作为诱变、转 基因等基因工程育种后物种鉴定的有效方式。 然后，作为建立遗传转化体系的基础，本论文研究Zeocin、两性霉素B (Amphotericin 长的影响。结果表明：s Zeocin中 limacinum对Zeoein最敏感．在2．5-4“g／ml 成活率降至210．279％(P(001)；slimacmum对两性霉素B、G418、氯霉素 较敏感，在14．20 pg／ml两性霉素B中的成活率降至5％以下(P0叭)，在140 OI)，在25 5—68lag／ml氧霉素中成活率 }tg／mlG418中的成活率为2．08％(PO 13％左右(P005)：slimacmum对氨苄青霉素、卡那霉素、链霉索不敏感，50-300 ／ag／ml的氨苄青霉素、卡那霉素、链霉索不能抑制其生长，成活率仍在80％咀上 ≈精壶蔺遗传转化体系的研究nd：DM音成进衽究中的应用 (P0 05)。本研究为裂殖壶菌基因工杜19$选标L0的选择提供了实验基础。 随后，奉实验参考NCBI的Genbank数据库-{-报道的pks基因序列，克隆了裂 limacinum 殖壶莳oucl68(s |=!；】。采川Zeocin{乍为抗性筛选标记，构建带有Zeocin抗性基因和部分pb基因的载 转化，得到6株转化菌株，经Zeocin抗性基因扩增及Southem blouing证实裂殖壶 菌pb基因已成功实现定点突变。6株转化菌株分耕为：一株Pbl基因中缺失 变，6株转化菌株与slimacinumOUCl68[L较，形态变化根大，细胞很小，细胞 内没有脂肪粒，有的有异味：生长速度变慢，其c02④基本处于不生长状态-发 limacinum OUCl68的一半，少的仅有0 酵培养6天后生物量蛀多的不足s 5∥L左 右：6株转化菌株合成DHA的PKS途径被打断，发酵6天后总脂含量和