分子发光分析法0.pptVIP

第五章 分子发光分析法Molecular Luminescence Analysis 一、 概述 分子荧光分析法是根据物质的分子荧光光谱进行定性，以荧光强度进行定量的一种分析方法。 荧光分析法的特点： 1.与紫外-可见分光度法比较，荧光分析法具有更高的灵敏度。 2.选择性好 荧光法既能依据发射光谱，又能依据吸收光谱来鉴定物质。 3.所需试样量少、操作方法简便。 4.能提供较的多分析参数、信息量大。 荧光分析法的缺点：应用范围不够广泛。 M=2S+1 S为电子自旋量子数的代数和(0或1)； 平行自旋比成对自旋稳定(洪特规则)，三重态能级比相应单重态能级低； 大多数有机分子的基态处于单重态； （3）激发态→基态的能量传递途径 (a) 跃迁类型：?*→?的荧光效率高，系间跨越过程的速率常数小，有利于荧光的产生； (b) 共轭效应：提高共轭度有利于增加荧光效率并产生红移； 根据荧光量子产率的定义，荧光强度 If 等于吸收的光量 Ia与荧光量子产率?的乘积： If = ? Ia 经常遇到的自淬灭现象有两种： （1）当荧光物质发出的荧光通过溶液时被荧光物质的基态分子所吸收，即自吸收现象。 （2）由于激发态分子之间的碰撞，导致非辐射跃迁概率增大，荧光效率降低。 三、荧光分析仪器 常用于测量荧光的仪器以下五个部件构成：激发光源、样品池、用于选择激发光波长和荧光波长的单色器以及检测器。 2. 温度对磷光强度的影响：随着温度的降低，磷光逐渐增强。 3.重原子效应：重原子的高核电荷使磷光分子的电子能级交错，容易引起或增强磷光分子的自旋轨道偶合作用，从而使S1→ T1的体系间窜跃概率增大，有利于增大磷光效率。 4.室温磷光 1．样品池 盛试液的石英液槽需放置在盛液氮的石英杜瓦瓶内。 2．磷光镜 利用磷光镜不仅可分别测出荧光和磷光强度，而且可以测出不同寿命的磷光。 第三节 化学发光与生物发光分析 一 、概述 化学发光指由化学反应能，激发物质分子所产生的光辐射。生物发 光指生物体系中的化学发光。 优点：灵敏度高、仪器简单、线性范围宽、分析速度快。 缺点：是能用于化学发光与生物发光分析的试剂相对有限，对发光机理的研究较少。 生物发光具有很高的发光效率。常用的化学发光效率较低，一般在0.01以下。 植物 Pyrocystis fusiformis 1. 化学发光反应的条件： （1）化学反应必须能放出足够的能量； （2）化学反应所释放的能量能够用于产生激发态分子； （ 3）处于激发态的分子以辐射跃迁的形式返回基态。 3. 化学发光反应的类型 （1） 液相化学发光 四、化学发光分析的应用 五、 生物发光分析法 在生物发光分析中，通常同时涉及到酶促反应和发光反应。这类发光分析法不仅灵敏度高，选择性也很高。例如三磷酸腺苷（ATP）的测定，就是生物发光分析的成功实例。在pH为7-8的介质中，在荧光虫素酶（E）和Mg（Ⅱ）离子的存在下，荧光虫素（LH2）与ATP反应，生成磷酸腺苷（AMP）荧光虫素和荧光虫素酸的复合物及镁的焦磷酸盐（ppi）。其反应如下： ATP + LH2 + E + Mg2 + pH = 7-8 AMP·LH2·E + Mgppi + 2H+ 然后复合物与氧反应，发生化学发光反应： AMP·LH2·E + O2 → [氧化荧光虫素]* + AMP + CO2 +H2O [氧化荧光素]* → 氧化荧光素 + hv（λmax =562nm） 用本法可测定10μL试样中10-14 g的ATP，线性范围可达6个数量级。 细菌发光也可用于发光分析。例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）的测定，在细菌中的黄素酶的作用下，在氧化型黄素单核苷酸（FMN）的存在下，发生下列生物发光反应： H+ + NADH + FMN NAD+ + FMNH2 FMNH2 + RCHO + O2 FMN + RCOOH + H2O + hv（λ最大=495nm）由于细菌的繁殖条件简单，经济，便于推广普及，但选择性不及酶高。 生物发光分析应用 (2)气相化学发光 在气相中，O3能氧化NO、乙烯等产生化学发光，原子氧也能氧化SO2、N