PCR生物技术.pptVIP

一、PCR技术总论 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称PCR，是一项在短时间内大量扩增特定的DNA片段的分子生物学技术。又称为无细胞克隆系统或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法，是基因扩增技术的一次重大革新，它可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍。 Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus) 二、PCR基本原理 (3) 引物的延伸(Extension): DNA模板—引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。 反应程序： 变性94~95oC （循环30次） 复性 延伸 37~55 oC 70~72 oC 72 oC延伸10min Tm值的估算 ① 20bp Tm=4（G+C）+2（A+T） ② 20bp Tm=69.3+0.41×100× (G+C)/L-650/L L=A+T+G+C,即引物碱基总数 退火温度: 在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性.复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合. PCR反应五要素 模板 （template） 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） Mg2+ （magnesium） 模板 单、双链DNA均可。 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。 DNA模板一般100ng /100?L。 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 引物（primer） 常规的PCR反应需要两种引物，它们作为DNA扩增的起始部分，能限定待扩增DNA序列的长度。 为了保证扩增的特异性和有效性，引物与模板相匹配部分应至少有15～18 bp。 引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增 引物设计的原则 ①引物长度： 15-30bp，常用为20bp左右 引物的有效长度不能大于 38 bp， ②引物扩增跨度：以500bp为宜 特定条件下可扩增长至10kb的片段 ③引物 3’端的碱基要求严格配对 特别是最末及倒数第二个碱基，以避免因末端碱基不配对而导致PCR失败 ④引物中有或能加上合适的酶切位点 被扩增的靶序列最好有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处 ⑤避免引物内部出现二级结构 避免两条引物间互补， 特别是 3’端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异性的扩增条带 ⑥引物碱基：G+C含量以40-60%为宜 G+C太少扩增效果不佳，变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因; G+C 过多,Tm过高, 高温环境对酶的活性有影响,易出现非特异条带 ATGC最好随机分布，避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列 ⑦引物的特异性： 引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性 DNA聚合酶 缓冲液 4)对标本的纯度要求低 不需分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及总 RNA 均可作为扩增模板 pcr反应体系 pcr技术的方法、步骤 引物设计原则 2．利用PCR技术检测环境中的基因工程菌株 了解基因工程菌操作的安全性和有效性。 3．PCR技术在环境微生物基因克隆中的应用 PCR技术弥补了用常规基因克隆方法很难获得的细菌基因： Zehr等（1989）报道，他们采用PCR技术直接从海水DNA样本中特异性地扩增其固氮基因（nif）片段，最终克隆到Trichodesmium thiebautii的nif基因，而Trichodesmiumthiebautii至今无法人工培养，用常规方法无法克隆到nif基因。 * * PCR技术的创建 Kary B. Mullis（穆利斯（美）） Khorana(1971)等提出在体外经DNA变性,与适当引物杂交,再用DNA聚合酶延伸,克隆DNA的设想。 1985年,Mullis发明了PCR技术,使Khorana的设想得到实现。 1988年Saiki等将耐热DNA聚合酶（Taq）引入