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碳源对长春花悬浮细胞培养中次级代谢作用的影响 次级代谢产物 糖类 乳糖（6%） 蔗糖（3%） 甘露糖醇（0.3~0.6mol/L） 长春花碱/mg?L-1 蛇根碱/mg ? L-1 游离氨基酸/mol ? L-1 50 —— —— 16.60 1.40 0.55 —— 21.50 2.86 （4）植物生长调节剂 植物生长调节剂在植物细胞培养中起着非常重要的作用，这种作用有时可能是关键性的。但是植物材料和生理状态的差异，无一定的规律可循，必须通过仔细的实验观察才能确定其合适的数量和种类。如Furuya在培养烟草细胞时发现，加入IAA时培养物中有尼古丁生成，但2，4-D存在时则不合成该化合物。说明不同植物激素及其不同组合形式均可显著影响代谢产物的产生。 （5）O2和pH ① O2 ：培养细胞生长过程需要维持其正常呼吸作用，悬浮细胞培养和固定化细胞培养时供氧方式有所不同，前者可采用搅拌和通气方式，搅拌速度通常为120~160r/min，过快易导致细胞破裂；后者仅能采用通气方式，一般使用含5%CO2的洁净空气，通气量应适当，过多或过少均影响细胞生长及次级代谢产物的合成。 ②pH：一般来说，最有利于培养细胞生长的pH在5~6之间。常用的培养基均具有一定的缓冲性质，在培养过程中培养液的pH变化较小。 （6）渗出物（exudates）：在细胞悬浮培养后期，培养液中常含有各种代谢产物，如某些初级代谢产物和次级代谢产物以及某些酸性物质、醇类、水解蛋白或活性蛋白等。如落花生悬浮培养细胞培养的后期培养液中含有27种多肽成分。此外，培养细胞分泌产物的量也取决于培养物的发育阶段，如在多叶羽扁豆悬浮细胞培养中，在活跃的生长期初期，酶的分泌量就达到了稳定期的水平，尔后酶活性随乙醇量的增加而降低。 次级代谢产物的累积往往在水解酶活性增加之前进行。 2、两步培养法 培养基的组成是细胞生长和次级代谢产物的形成最直接、也是最重要的影响因素。为了得到最佳生长和最佳次级代谢产物，提出了两步法。第一步主要使用适合细胞生长的培养基，称为生长培养基（growth medium）第二步主要用适于次级代谢产物合成的培养基，称为生产培养基。 两种培养基往往有较大的区别，前者是为了实现细胞的高生产率，后者通常具有较低含量的硝酸盐和磷酸盐，并含有较低的糖份或较少的碳源。书中介绍了长春花细胞培养中生长培养基与生产培养基的区别主要为前者使用了肌醇及维生素类成分，而后者则不含上述成分，在生长调节剂的使用上，前者应用2，4-D刺激细胞生长，而后者加入6-BA以便利于次级代谢产物的产生。 3、培养环境的外部因素 （1）温度 培养物中次级代谢产物产生的最佳温度为20~28℃。在一定温度（≤15 ℃ ）下，细胞不再生长，次级代谢产物也不再产生。但应该指出的是，在某些极端情况下（如30 ℃），细胞也能正常生长。终产物和中间产物的累积，甚至与其生物合成直接相关的化合物，也并非需要相同的温度。低温对次级代谢产物产生的影响类似于2，4-D的抑制作用。当培养温度与培养物正常生长所要求的温度相差很大时，可引起某些应激效应以及对次级代谢产物产生的激活作用。温度的变化尚可引起产物类型在质和量上的改变，个别情况下由于激活了新的生物合成途径也可能产生新的代谢物质。 4、培养环境的外部因素 （2）搅拌频率 植物培养细胞的产率与发酵罐的搅拌速度有关，具体表现在发酵液中的溶氧浓度和机械搅拌对细胞所产生的剪切力上，如上述因素对海巴戟长方形细胞（累积蒽醌类成分）、产生甜菜苷（betanine）的甜菜（Beta vulgaris）细胞和累积蛇根碱的长春花细胞等的影响就非常明显。但搅拌频率也不宜过小，如低于28r/min时，次级代谢产物的生物合成反应就有可能发生反转。 4、培养环境的外部因素 （3）培养容器的影响 植物培养细胞次级代谢产物的产生可因为所用培养容器的大小和搅拌装置的不同而得到不同的结果。如小规模实验室培养所用的培养容器（50~500ml）具有较高的氧转移率，通过简单的定期搅拌，培养物的每个部位均可得到比大规模培养更好的氧供应。用于生产次级代谢产物反应器中的搅拌器对细胞产率可产生一定的影响，这些差异及由剪切力引起的不良影响可通过使用气升式发酵罐或一个沿水平轴转动的发酵罐而予以避免。但因为植物细胞生长和次级代谢产物的生产过程是完全分离的，所以这对细胞生产过程会有不利影响。延长稳定期就意味着延长培养时间，从而增加成本、增大污染机会等，可以通过两步培养等方法解决。 4、培养环境的外部因素 （4）光的影响 光照时间、光质和光强对次生代谢产物（如黄酮、黄酮醇、花色素苷、挥发油等）的累积都有一定影响。 第六节 植物细胞培养的生物反应器 要研制适合于高等植物细胞大量培养的生物反应器，首先应对植物细胞的特