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（二）、免疫细胞化学方法 报告分子（ reportermolecules） 在杂交后探测技术中，为显 示探针标记物而使用的免疫细胞 化学标记物常被叫做报告分子 即与抗体（或亲和素、 A蛋白、）联结，最终在 显微镜下可见的分子： 荧光素 胶体金 酶—-过氧化物酶-H2O2和DAB 碱性磷酸酶-NBT/BCIP ※用地高辛标记的探针用荧光素、胶体金、酶标记抗地高辛抗体来显示 依据免疫细胞化学原 理用直接法或间接法 来显示探针标记物 四、原位杂交技术的应用 细胞特异mRNA转录的定位，用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究。 感染组织中病毒DNA/RNA的检测和定位。 癌基因、抑癌基因和各种功能基因在转录水平的表达和变化的检测。 基因在染色体上的定位和检测染色体的变化 间期细胞遗传学的研究 疾病的基因变化的研究 果因PPT工作室 /guoyinppt 原 位 杂 交 技 术 2012-12-06 原 位 杂 交 技 术 一 原位杂交技术的历史发展 二 原位杂交技术的原理及分类 三 原位杂交技术的一般过程 四 原位杂交技术的应用 一、原位杂交技术的历史发展 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是分子生物学、组织化学及细胞学相结合而产生的一门新兴技术，始于20世纪60年代。1969年美国耶鲁大学的Gall等首先用爪蟾核糖体基因探针与其卵母细胞杂交，将该基因进行定位，与此同时 Buongiorno—Nardelli和Amaldi等(1970)相继利用同位素标记核酸探针进行了细胞或组织的基因定位，从而创造了原位杂交技术。自此以后，由于分子生物学技术的迅猛发展，特别是20世纪70年代末到80年代初，分子克隆、质粒和噬菌体DNA的构建成功，为原位杂交技术的发展奠定了深厚的技术基础。 二、原位杂交技术的原理及分类 概念： 原位杂交技术(In situ hybridization，ISH)是用标记的核酸探针，经放射自显影或非放射检测体系，在组织，细胞、间期核及染色体上对核酸进行定位和相对定量研究的一种手段。 原理：利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即 探针)与组织、细胞或染色体上待测 DNA或 RNA互补配对，结合成专一 的核酸杂交分子，经一定的检测手段 将待测核酸在组织、细胞或染色体上 的位置显示出来。 分类 1、 基因组原位杂交技术 　　基因组原位杂交(GISH)技术是20世纪80年代末发展起来的一种原位杂交技术。它主要是利用物种之间DNA同源性的差异，用另一物种的基因组DNA以适当的浓度作封阻，在靶染色体上进行原位杂交。 2、荧光原位杂交技术 　　荧光原位杂交(FISH)技术是在已有的放射性 原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放 射性DNA分子原位杂交技术。它利用荧光标记 的核酸片段为探针，与染色体上或DNA显微切 片上的特异fl-N：~行杂交，通过荧光检测系 统(荧光显微镜)检测信号DNA序列在染色体或 DNA显微切片上的目的DNA序列，进而确定其杂 交位点。 3 、多彩色荧光原位杂交技术 　　多彩色荧光原位杂交(mFISH)是在荧 光原位杂交技术的基础上发展起来的 一种新技术，它用几种不同颜色的荧 光素单独或混合标记的探针进行原位 杂交，能同时检测多个靶位，各靶位 在荧光显微镜下和照片上的颜色不同， 呈现多种色彩。 4、原位PCR 　　原位PCR技术是常规的原位杂交技术与PCR技术的有机结合，即通过PCR技术对靶核酸序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增使其拷贝数增加，然后通过原位杂交技术进行检测，从而对靶核酸序列进行定性、定位和定量分析。 三、原位杂交技术的一般过程 以经过标记的已知核酸分子为探针 以细胞内与探针序列互补的特异核酸分子为靶分子 在一定条件下使探针与靶核酸分子在原位发生杂交 再对其探测 探针 标记 靶核酸分子 杂交 检测 一）、探针 是含有互补顺序的外源性被标记的DNA或RNA片段，是在原位杂交中用于检测细胞内特定DNA或RNA顺序定