ZX_基因工程的酶学基础演示教学.ppt

连接酶反应的最佳温度是37?C。 四、连接反应的温度 1. 最佳温度 但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。 2. 实用温度 所以一般采用 4~16?C 增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。 1. DNA末端的浓度 五、影响连接反应的因素 10~20倍 2. 插入片段与载体的浓度比例 两种构型：线状分子和环状分子 与DNA浓度及DNA分子长度相关 3. 反应温度 黏性末端：12～16℃ 平头末端：10～20℃ 4. ATP浓度 一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L. ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接 ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。 六、DNA连接的反应体系 酶切纯化后的DNA片断 连接缓冲液 DNA连接酶 从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。 七、平头双链DNA片段的连接操作 加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接） 加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会 加入10% PEG8000，促进大分子之间的有效作用 加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200 mM 提高平头末端连接效率的方法包括： DNA连接酶 DNA聚合酶 相同点 作用实质 化学本质 不 同 点 模板 作用对象 作用结果 用途 都能催化形成磷酸二酯键 都是蛋白质 不需要 需要 形成完整的重组DNA分子 形成DNA的一条链 基因工程 DNA复制 DNA连接酶与DNA聚合酶的比较 只能将单个核苷酸连接到已有的DNA片段上，形成磷酸二酯键 在两个DNA片段之间形成磷酸二酯键 核苷酸分子的连接： A T G C A T G C DNA聚合酶连接单链DNA 把单个脱氧核苷酸连接到DNA片段上 第三节 DNA聚合酶 DNA聚合酶（DNA polymerase) 能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用. 一、基因工程中常用的DNA聚合酶 大肠杆菌DNA聚合酶 2. Klenow fragment 3. T7 DNA聚合酶 4. T4 DNA聚合酶 5. 修饰过的T7 DNA聚合酶 6. 逆转录酶 7.Taq DNA聚合酶 A A T T G C A A T T A A T T DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶 DNA聚合酶的作用 返回 1. 共同特点 把dNTPs连续地加到引物的3’－OH端 2. 主要区别 T7 DNA聚合酶可以连续添加数千个dNTPs而不从模板上掉下来。 其它几种DNA聚合酶只能连续添加10多个dNTPs就会从模板上解离下来。 二、常用的DNA聚合酶的特点 持续合成能力和外切酶活性不同。 DNA聚合酶 3’?5’外 切酶活性 5’?3’外切酶活性 聚合速率 持续能力 大肠杆菌DNA聚合酶 低 有 中 低 Klenow fragment 低 无 中 低 T4 DNA聚合酶 高 无 中 低 T7 DNA聚合酶 高 无 快 高 化学修饰T7 DNA聚合酶 低 无 快 高 遗传修饰T7DNA聚合酶 无 无 快 高 逆转录酶 无 无 低 中 Taq DNA聚合酶 无 有 快 高 3. 常用DNA聚合酶的特性比较 三、DNA聚合酶在基因工程中的用途 1. 大肠杆菌DNA聚合酶 Ⅰ 主要用来制备带放射性标记的DNA探针（32P标记）。 （1）大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的性质 ①一条单链多肽 ②5’?3’外切酶活性位于N端 ③用枯草杆菌蛋白酶处理可以切掉N端的5’?3’外切酶活性部分,就成为Klenow fragment。 ① 底物： dNTPs（dATP、dGTP、dCTP、dTTP） ② Mg2+ ③ 带有3’-OH游离端的引物 ④ DNA模板 （2）DNA聚合酶I（Pol I）的反应条件 -OH 5’ 3’ dNTPs 标记 ① 核酸探针（probe） 能够同某种被研究的核酸序列特异性结合的，带有标记的寡聚核酸分子。 （3）用DNA聚合酶Ⅰ制备探针 已知序列的核酸片断 显示位置 与互补的待测序列杂交 标记 已知序列的核酸片断 ② 探针的标记方式 标记 已知序列的核酸片断 带有放射性的已知序列的核酸片断 5’ 3’ ③ DNA聚合酶I 对探针序列的标记 切口平移法(nick translation )： 放射性同位素标记： 当存在dNTP时，DNA聚合酶 I 同时具备5’?3’外切酶活性和5’?3’的聚合酶活性。 5’?3’外切酶活性从DNA缺口的下一段DNA5’端除去一个核苷酸后，聚合酶活