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金开瑞客户应用凝胶电泳迁移率技术文章分享 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物 客户文章分享：在假单胞菌 pf- 5 中 Hfq 对 lipA 表达的调控作 用 题目：The role of Hfq in regulation oflipA expression in Pseudomonasprotegens Pf-5 期刊：Scientific Reports 影响因子：4.259 合作技术：EMSA 研究背景 脂肪酶是一种重要的工业酶，它存在于多种动物、植物和微生物中。商业脂肪酶主要来源于 微生物。目前，脂肪酶被用于食品、饮料、石油、洗涤剂、化妆品、纸张、污染控制和生物 能源工业。然而，传统发酵条件的优化也不能克服细菌脂肪酶的生产过程中的问题。因此为 了解决这些问题，有必要阐明其对脂肪酶的基因表达调控的分子机制。 假单胞菌脂肪酶是一种被研究的较清楚的脂肪酶。 然而很少有针对脂肪酶表达调控的机制进 行研究。Hfq 是一种广泛调控蛋白，能够影响细菌生存的各种生理过程，控制多种基因的表 达，调节细菌的蠕动，参与细菌群感应系统的管理。在本研究中，通过敲除或过表达 hfq 和 rsmY 基因，研究 Hfq 对脂肪酶表达的调控。研究发现，Hfq 在转录水平和翻译水平调节 脂肪酶的表达， 主要表现在转录水平的调控。 同时 Hfq 还调控 rsmY 的表达及维持 rsmY 的稳 定性。 将 Hfq / rsmY 双基因敲除， 发现 hfq 可以直接结合 rsmY 来调控脂肪酶的激活。 总之， 这项研究表明在假单胞菌 pf - 5 中，Hfq 通过在转录水平上调控 rsmY 的表达来影响脂肪酶 的表达。 研究内容及结果 为了研究 Hfq 和 lipA 之间的关系，本文先通过同源重组的方法敲除及突变 hfq 基因，得到 四个基因的突变株。并通过 PCR 的方法检测基因敲降成功。将 hfq 突变后检测了 Pf-5 的生 长、 脂肪酶的表达及活性， 同时检测了β -半乳糖苷酶的活性。 实验结果显示 hfq 被突变后， 单胞菌 Pf-5 生长水平受到抑制， 脂肪酶转录水平表达受到抑制， 同时脂肪酶活性显著降低， β -半乳糖苷酶的活性也显著降低。 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物 图1 hfq 突变对脂肪酶表达的影响 在野生型假单胞菌 pf- 5 中，通过同源重组的方法过表达 hfq，恢复了 hfq 突变体中脂肪酶 的相对活性，结果表明 hfq 基因敲除在启动子水平上影响脂肪酶表达以及活性。此外，在 hfq 突变型中过表达 hfq 后检测脂肪酶和β -半乳糖苷酶的活性，结果显示与野生型相比， 这两种酶的活性都恢复了。这些结果说明 hfq 在转录水平和翻译水平参与 lipA 的表达以及 脂肪酶表达的调控。 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物 图 2 hfq 突变对脂肪酶表达的影响 将 phrs、rsmA，rsmE、remY、rsmZ 的启动子构建到 lacZ 报告基因的启动子区域，转染进 hfq 敲降后的假单胞菌，检测β -半乳糖苷酶活性。结果显示，转染 phrs、rsmA，rsmE 重组 质粒后β -半乳糖苷酶的活性没有变化，rsmZ 的活性发生了轻微的变化，而 rsmY 的活性变 化很明显。这些结果表明 hfq 可能通过 remY 或 rsmZ 影响 lipA 的表达。 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物 图 3 hfq 对调控几种 RNA 活性的影响 使用纯化后的 hfq 蛋白，通过 EMSA 实验进一步研究 hfq 与 rsmY 是否结合。EMSA 实验结果 显示 hfq 不能与 rsmA、rsmE、rsmZ 的启动子序列结合，但是可以与 rsmY 结合。竞争性 EMSA 实验结果显示，随着非标记 rsmY 探针浓度增加，与 hfq 蛋白结合的标记探针越来越少，这 个结果说明 hfq 蛋白可以与 rsmY 结合。 图 4 hfq 蛋白纯化及 EMSA 实验 据报道， Hfq 和 rsmY 的结合可以维持 rsmY 的稳定。 然而， 在 pf - 5 中， Hfq 没有被研究过。 因此本文先研究了利福平处理后，pf-5 野生型和 hfq 突变株中 rsmY 的稳定性变化。结果表 明， 与野生型相比， hfq 突变体中 rsmY 的稳定性明显降低。 这个结果显示 Hfq 通过调节 rsmY 的稳定性来影响表达 rsmY，进而影响脂肪酶的表达。 一站式科研技术服务商—武汉金开瑞生物 图 5 Hfq 对 RsmY 稳定性的影响 通过 PCR 确定 rsmY 基因被敲除后(图 6A)，对脂肪酶表达进行了测定，验证了 rsmY 在调节 脂肪酶表达中的作用。实验结果 hfq 被敲除的细胞中脂肪酶表达量减少。hfq 和