单克隆抗体与基因工程抗体的制备教程.pptVIP

模拟天然全套抗体库 抗体文库可以达到或超过1011库容,能包含B细胞全部克隆 建库的外源基因来自人体多克隆细胞的总mRNA 通用引物具有人的种属普遍性 抗体的VH和VL基因的随机重组也增加了抗体的多样性 （二）噬菌体抗体库技术的特点 避开了人工免疫和杂交瘤技术 抗体库的大容量 抗体库极高的筛选效率 可获得高亲和力的人源化抗体 VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟的过程 所用的抗体基因又来自人体 第四节 单克隆抗体的应用 检验医学诊断试剂 蛋白质的提纯 小分子抗体的应用 抗体融合蛋白的应用 双特异抗体的应用 抗体库技术的应用和前景 病原微生物抗原、抗体的检测 肿瘤抗原的检测 免疫细胞及其亚群的的检测 激素测定 细胞因子的测定 一、检验医学诊断试剂 病原体测定： 肝炎病毒－HAV,HBV,HCV,HDV,HEV TORCH－弓形虫,风疹病毒,巨细胞病毒 ，单纯疱疹病毒 细胞表面CD测定： CD4/CD8:Th/Tc 白血病的分型 激素的测定： 内分泌疾病的诊断 药物测定(TDM)： 抗排斥药物抗肿瘤药物地高辛 研究工作中的探针： 越来越多未知功能cDNA的克隆 对复杂的基因功能和多肽蛋白功能的研究需求增加 免疫沉淀 二、蛋白质的提纯 单克隆抗体是亲和层析中重要的配体。将单克隆抗体吸附在一个惰性的固相基质（如Speharose 2B、4B、6B等）上，并制备成层析柱。当样品流经层析柱时，待分离的抗原可与固相的单克隆抗体发生特异性结合，其余成分不能与之结合。将层析柱充分洗脱后，改变洗脱液的离子强度或pH，欲分离的抗原与抗体解离，收集洗脱液便可得到欲纯化的抗原。 MACS 定义： 分子量较小但具有抗原结合功能的分子片段 优点： 分子量小,穿透性强,抗原性低 不含Fc段，不会与带有Fc段受体的细胞结合，不良反应少 可在原核系统表达及易于基因工程操作 半衰期短，有利于及时中和及清除毒素 三、小分子抗体的应用 应用： 用于肿瘤的导向治疗 肿瘤的影像分布 基因治疗 细胞内抗体： 在细胞内表达 特异性识别某一基因产物 可干扰该基因产物的生物活性 研究基因结构与功能的关系 肿瘤的体内显像诊断 单链抗体排除速度快，穿透力强，在肿瘤组织中的分布指数较完整抗体分子高 放射显像时，放射性核素排除较快，对身体危害程度小，显像的本底较低 理想的显像定位诊断载体 病毒的诊断和抗病毒感染 血液性疾病的诊断 白血病的免疫诊断及分型 四、抗体融合蛋白的应用 在体外免疫检测中的应用 自身红细胞凝集试验 快速检测HBV和HIV病原体等 避免化学交联减低两者的活性，从而提高酶免疫检测的敏感度 用双特异抗体作为二抗，检测限达1ng/ml 五、双特异抗体的应用 在体内肿瘤放射免疫显像诊断中的应用 方法： 双特异抗体的一只臂结合靶抗原，一只臂结合半抗原螯合剂，后者可选择性地与放射性核素结合，利用二次导向系统显示 特点： 更高的的灵敏度和清晰度 在体内免疫治疗中的应用 抗体分子可与放射性核素、细胞毒药物、毒素、等多种分子相融合，这些分子在抗体结合靶分子后可提供重要辅助功能 双功能抗体可有效针对低水平的肿瘤相关抗原，并将细胞毒物质输送到肿瘤细胞 抗体还可与携带药物的脂质体、各种PEG偶联，从而增强体内运输和药代动力学 六、抗体库技术的应用和前景 在肿瘤体外诊断中的应用 在肿瘤诊断中的应用 在肿瘤治疗中的应用? 1．杂交瘤技术是如何问世的？其基本原理是什么？ 2．什么是单克隆抗体？其特性和局限性如何？与多克隆抗 体有何异同？ 3．杂交瘤细胞的克隆方法有哪些？ 4．细胞株冻融的原则是什么？ 5．大量制备单克隆抗体的方法有哪些，各有哪些优缺点？ 6．单克隆抗体的性质鉴定的方法有哪些？ 7．叙述单克隆抗体的制备流程和应用。 8．叙述基因工程抗体的概念和优点。 9．基因工程抗体的种类和应用。 10．抗体库技术的原理和特性有哪些？ 思考题 小结 杂交瘤单克隆抗体制备技术的原理是利用聚乙二醇作为细胞融合剂，使免疫的小鼠脾细?胞与具有在体外不断繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一?体，在HAT选择性培养基的作用下，只让融合成功的杂交瘤细胞生长，经过反复的免疫学检测筛选和单个细胞培养（克隆化）,最终获得既能产生所需单克隆抗体,又能不断繁殖的杂交瘤?细胞系，将这种细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在其产生的腹水中即可得到高效价的单克隆抗体。 20世纪80年代诞生了应用DNA重组及蛋白工程技术对编码抗体基因按不同需要进行改造和装配，经导入适当的受体细胞后重新表达的抗体，称为基因工程抗体，它具有如下优点：①通过基因工程技术的改造，可以降低甚至消除人体对抗体的排斥反应；