免疫磁球性能评价研究.docVIP

免疫磁球性能影响因素的研究 杜美红1( 代凤英2 许迪莘3 张淼2 孙永军1 左嘉1 （1 北京市理化分析测试中心，北京市食品安全分析测试工程技术研究中心，北京 100089；2 中国科学院过程工程研究所，生化工程国家重点实验室，北京100190；3 北京市科学器材公司，北京 100010） 摘要:利用化学键法制备沙门氏菌（anti-Salmonella）捕获富集用免疫磁球，通过平板培养计数法确定其对目标菌的捕获率，对影响免疫磁球性能的磁分离时间、目标菌捕获率、特异性及敏感性等主要因素进行了研究。结果表明，免疫磁球在不同的磁分离时间内对目标菌的捕获率不同，在一定的磁分离时间内捕获率能达到最高；磁球与抗体的投料比影响免疫磁球的捕获性能，磁球200 μg、抗体25 μg的投料制备的免疫磁球能获得40%以上的捕获效率，具有一定的灵敏性（100 cfu/mL的目标菌捕获率为50%以上）；免疫磁球的粒径影响其捕获性能，大粒径（1000 nm）免疫磁球目标菌捕获率小于小粒径（180 nm）免疫磁球目标菌捕获率；免疫磁球对单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌非特异性在10%以下，在一定程度上影响免疫磁球的特异性捕获。本研究为免疫磁球产品的应用转化奠定了基础，为免疫磁球在微生物快速检测提供了科学的试验数据。 关键词:免疫磁球，捕获率，磁分离时间，特异性，敏感性 中图分类号:Q939.91 文献标识码:A前言 免疫磁性微球是免疫学与磁性微球技术结合的一类新型材料，它是在磁性复合微球表面引入活性基团，通过表面偶联反应或者吸附作用将抗体结合到微球上，形成免疫磁性微球。二十世纪八十年代，Ugelstad等人成功制成了第一批免疫磁性微球用于分离细胞并取得良好的效果[1]。此后，各国学者对免疫磁性微球的制备与应用展开了大量研究，免疫磁性微球以其磁性和免疫特异性的特点，在细胞的分离纯化、微生物富集与分离、蛋白质分离和纯化、核酸分离纯化等方面迅速得到广泛应用[2-5]，从而引起了国内外诸多公司及企业对免疫磁球系列产品的开发与研制，商用和科研用免疫磁球逐步市场化，对其性能的研究与评价成为必需。免疫磁球性能受磁响应时间、目标捕获率、捕获特异性、磁球稳定性等多种因素影响，本文以抗沙门氏菌（anti-Salmonella）免疫磁球为例，从免疫磁球的主要技术参数出发，探讨对免疫磁球性能的影响，旨在为免疫磁球的应用转化奠定基础，为免疫磁球的广泛应用提供有价值的参考及科学依据。 1材料与方法 1.1试剂与仪器 AllMag PM3-2磁球（粒径180 nm，上海奥润微纳新材料科技有限公司）、Dynabeds Myone Carboxyl（粒径1000 nm，北京思尔成生物技术有限公司），1-3-二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）、N-羟基丁二酰亚胺（NHS）（北京百灵威科技有限公司），anti-Salmonella多克隆抗体（01-95-99, KPL，美国），磁力架（0.5T，Invitrogen公司），鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）（ATCC 14028）、单增李斯特菌（ATCC 19115）、金黄色葡萄球菌（ATCC 25923）、志贺氏菌（ATCC 12022）、MH琼脂、营养琼脂（北京陆桥技术有限责任公司）、超高分辨率场发射扫描电镜（MERLN 德国）；纯水仪（Mili-Q MILLIPORE美国）。 1.2 方法 1.2.1免疫磁球制备 分别取AllMag PM 3-20磁球、Dynabeads Myone Carboxyl磁球200 μg到离心管中，用无菌磷酸缓冲液（PBS）洗涤两次，分别加入新配制的EDC和NHS溶液到离心管中，涡旋混匀，37 ℃活化30 min后移去多余的液体。加入25 μg anti-Salmonella多克隆抗体到离心管中，37 ℃偶联3 h。移去多余液体，加1% BSA于37 ℃ 30 min封闭免疫磁球。 1.2.2磁分离时间考察 将培养好的沙门氏菌液稀释至约102 cfu/mL，取1 mL菌液放入2 mL离心管中，分别加入相同一定量的anti-Salmonella免疫磁球，轻轻吹打均匀；在室温下轻轻旋转30 min；将离心管置于磁力架上，分别在5 min、10 min、15 min、20 min、30 min时小心取出离心管中全部液体（上清液）；去磁场后，加1 mL PBS冲洗离心管壁上的菌体-免疫磁球，并均匀打散（下沉液）；将上清液与下沉液分别进行适当稀释，营养琼脂平板37 ℃培养24～48 h后计数；同时将原沙门氏菌液平板培养计数。捕获率=下沉细菌总数/（上清细菌总数+下沉细菌总数）。 1.2.3捕获率考察 AllMag PM3-