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PCR检测临床意义及常见问题 科华生物 王静 不同方法、不同病毒的窗口期 HBV markers during early infection HCV Viremia during early infection HIV Viremia during early infection 案例 HBsAb、HBeAg 阳性 Roche、雅培Axsym、强生 肝功能(GPT)正常 荧光定量PCR阴性 丙肝抗体阳性、RNA 104IU/ml 核酸是最基本的生命物质，其贮存着生物体的全部遗传信息，直接或间接的参与所有生命过程。 理论上任何疾病都能在核酸水平找到证据。 随着对核酸功能认识的逐渐深入，核酸检测在医疗诊治过程中起着越来越重要的作用。 核酸检测在临床上主要应用于： 能用于遗传性疾病、肿瘤以及感染性疾病的筛查以及疗效监测等方面 由于对基因功能认识的限制，国内主要进行病原体载量检测，用于疗效监测。 核酸检测的特点 核酸检测相对于传统的生化、免疫检测有着不同的检测方法及生理意义。 早期筛查：应用PCR进行早期筛查主要是因为PCR的高灵敏和短的窗口期。 疗效监测：反映抗病毒治疗效果的最好指标。 核酸是病毒存在的直接证据，用核酸定量作为监测指标更灵敏。而传统的血清标志物有滞后效应，效果不如核酸理想。 与酶免检测互补： 两种检测具有互补性，核酸检测可以避免亚型或免疫沉寂引起的假阴性，但不能反应机体的免疫情况，而血清学检测可以。 核酸的基本概念（PCR） 认识核酸 核酸： 生物贮存遗传信息物质的生物大分子，是生命的直接标志 核苷： 核酸的基本结构单位，包含一个碱基、一分子的糖和一个磷酸基团 分为脱氧核糖核苷和核糖核苷两类 脱氧核糖核酸DNA： 脱氧核糖核苷构成，结构较稳定，通常由双链构成 核糖核酸RNA： 核糖核苷构成，结构不稳定，易降解，单链 中心法则 聚合酶链式反应（PCR） PCR定义 聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。 PCR基本原理 ［PCR原理］ DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，并设计引物做启动子，加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。 三个步骤 变性 (双链分开) 退火(引物互补) 延伸(聚合酶催化合成) PCR反应的基本条件 模板核酸 DNA or cDNA 引物 一对特异的寡核苷酸 缓冲液 Tris-Cl,K,蛋白质,明胶等 Mg2+ 三磷酸脱氧核苷酸（dNTP） 耐热DNA聚合酶 (Taq Polymerase) PCR图解 PCR温度控制 温度和循环参数 a.变性温度与时间 92-96℃,3-30sec b.复性温度与时间 45-65℃,30-60sec c.延伸温度与时间 68-72℃,1-3min d.循环数 20-45 cycles 逆转录PCR（RT－PCR） RNA 在绝大多数生物中RNA是蛋白翻译表达的中间产物，但少数病毒没有DNA，由RNA贮存遗传信息 RNA通常是单链，且易分解，检测难度较大 RT－PCR 用PCR检测RNA，要先将RNA用逆转录酶逆转录为cDNA，然后再进行PCR，故称为逆转录PCR PCR检验的发展历程 实时荧光PCR定量技术 实时荧光PCR定量技术原理 Taqman荧光探针为一寡核苷 酸，两端分别标记一个荧光发射 基团和一个荧光淬灭基团。探针 完整时，发射基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收；PCR扩增时， Taq酶的5’－3’外切酶活性将探针 酶切降解，使荧光发射基团和荧 光淬灭基团分离，从而荧光监测 系统可接收到荧光信号，即每扩 增一条DNA链，就有一个荧光分 子形成，实现了荧光信号的累积 与PCR产物形成完全同步。从而 实现定量。 PCR定量理论基础 E本次循环的扩增效率（0≤E≤1） Cn＝C×(1＋E)n LogCn＝LogC＋nlog(1+E) N＝LogCn/log(1+E)－ LogC/ log(1+E) Y＝-X/log(1+E)＋b logCn为常数，n为Y，L