6 免疫球蛋白标记技术应用_PPT课件.pptVIP

二、ELISA试验条件的选择 免疫吸附条件 酶标记的抗体（或抗原） 酶的底物 洗涤液 酶反应终止液 阳性对照品和阴性对照品 * (一）免疫吸附条件 固相载体 包被的方式 包被用抗原 包被用抗体 包被的条件 封闭 * 1. 固相载体的选择 不参与化学反应 ，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性 吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各孔之间性能相近 最常用的是聚苯乙烯微量滴定板 * 吸附性能检查方法 人IgG包被 加入酶标抗人IgG 抗体 加底物显色 终止酶反应，测每孔吸光度。 控制反应条件，使各孔读数在吸光度0.8左右。计算全部 读数的平均值。所有单个读数与全部读数的均数之差，应小于10% 。 对比测定阳性血清和阴性血清，观察是否存在明显差异，若二者相差10倍以上为合格 * 2.包被的方式 抗体的包被一般采用直接吸附法 蛋白质抗原大多也可采用与抗体相似的方法包被 抗原决定簇存在于或邻近于疏水区域时，可采用间接捕获包被法,抗体预包被 （也适用含杂质多的或含量低的抗原） 非蛋白质抗原可采用特殊的包被方式例如，DNA或脂类物质作为包被抗原 包被 (coating)，是抗原或抗体结合到固相载体表面的过程。 * 3.包被用抗原 天然抗原 重组抗原 合成多肽抗原 （一般只含1个抗原决定簇） * 4.包被用抗体 包被固相载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水或培养液。 抗血清不能直接用于包被，应先提取IgG 腹水中单抗的浓度较高，特异性亦较强，一般可将腹水作适当稀释后直接包被，必要时也可用纯化的IgG 在某些情 况下，用多种单抗混合包被，可取得更好的效果 * 5.包被的条件 包被用抗原或抗体的浓度 需通过实验与酶结合物的浓度协调选定。一般蛋白质的包被浓度为100ng/ml-2 0ug/ml。 包被液的pH 一般采用 pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液 包被的温度和时间 4-8℃冰箱中放置过夜，37℃中保温2小时 * 6.封闭 最常用的封闭剂是0.05%-0.5%的牛血清白蛋白，也有用10%的小牛血清或1%明胶作为封闭剂的。 封闭 (blocking)是继包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。 * （二）酶标记的抗体（或抗原） 最适的工作浓度就是指结合物稀释至这一浓度时，能维护一个低的本底，并获得测定的最佳灵 敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。 足够抗体（抗原）包被，加不同稀释度的酶结合物，显色后测OD，OD为1时对应的稀释度为最适浓度。 * （三）酶的底物 常用的供氢体有邻苯二胺(OPD) 和四甲基联苯胺(TMB) 。 OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰。 OPD见光易变质，与过氧化氢混 合成底物应用液后更不稳定，须现配置现用。 TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量，最适吸收波长为405nm * （四）洗涤液 在板式ELISA中，常用的稀释液为含0.05%吐温20磷酸缓冲盐水。 * （五）酶反应终止液 常用的HRP反应终止液为硫酸，其浓度按加量及比色液的最终体积而异，在板式ELISA中一般采用2mol/L。 * （六）阳性对照品和阴性对照品 阳性对照品(positive control)和阴性对照品(negative control)是检验试验有效性的控制品，同时也作为判断结果的对照，因此对照品，特别是阳性对照品的基本组成应尽量与检测标本的组成相一致。 * * 标记抗体的应用 荧光抗体标记技术 酶标抗体技术 荧光抗体染色技术 荧光抗体标记技术（fluorescent-labeled antibody technique）是指用荧光素对抗体或抗原进行标记，然后用荧光显微镜观察所标记的荧光以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。 * 荧光抗体技术的原理与方法 直接法操作简便，特异性高，非特异荧光染色因素少；缺点是敏感度偏低，每检查一种抗原需制备相应的特异荧光抗体。 间接法灵敏度高，且在不同抗原的检测中只需用一种荧光抗体。 补体法敏感度高，且只需一种抗体。但易出现非特异性染色，加之补体不稳定，每次需采新鲜豚鼠血清，操作复杂。因此较少应用。 双标记法用两种荧光素分别标记不同抗体，对同一标本作荧光染色。在有两种相应抗原存在时，可同时见到两种荧光色泽。 * 直接法 间接法 补体法 双标记法 * 基本过程 标本制备 固 定 洗 涤 染 色 观 察 * （一）标本的制备 涂片或压印片 细菌培养物、感染动物的组织