第十节 谷胱甘肽过氧化物酶GSHPx活力测定.docVIP

1.3.6.2 血或组织中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH－Px）活力测定 1.3.6.2.1 原理 谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）是体内存在的一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统。对防止体内自由基引起膜脂质过氧化特别重要，其活力以催化GSH氧化的反应速度，及单位时间内GSH减少的量来表示，GSH和5,5’-二硫对硝基苯甲酸（DTNB）反应在GSH-Px催化下可生成黄色的5-硫代2-硝基苯甲酸阴离子，于423nm波长有最大吸收峰，测定该离子浓度，即可计算出GSH减少的量，由于GSH能进行非酶反应氧化，所以最后计算酶活力时，必须扣除非酶反应所引起的GSH减少。 1.3.6.2.2 试剂和仪器 仪器：可见光分光光度计、酶标仪、低温高速离心机、匀浆器、恒温水浴锅、微量加样器 试剂：叠氮钠磷酸缓冲液 pH7.0 NaN3 16.25mg 终浓度2.5mmol/L EDTA-Na2 7.44mg 终浓度0.2mmol/L Na2HPO4 1.732g 终浓度0.2mol/L NaH2PO4 1.076g 终浓度0.2mol/L 加蒸馏水至100mL，用少量HCL、NaOH调pH7.0，4℃保存。 1mmol/L谷胱甘肽（还原型GSH）溶液 GSH 30.7mg加叠氮钠磷酸缓冲液至100mL，临用前配制，冰冻保存1－2日。 1.25－1.5mmol/LH2O2溶液 取30％H2O2 0.15－0.17mL，用双蒸水稀释至100mL，作为贮备液，4℃避光保存，临用前将贮备液用双蒸水稀释10倍即可。 偏磷酸沉淀液 HPO3 16.7g（先用蒸馏水溶解） EDTA 0.5g NaCl 280g 加蒸馏水至1000mL，用普通滤纸过滤，室温保存。 0.32mol/LNa2HPO4溶液: Na2HPO4 22.7g加蒸馏水至500mL，室温保存。 DTNB显色液 DTNB 40mg 柠檬酸三钠 1.0g 加蒸馏水至100mL，4℃避光保存1个月。 0.2M磷酸缓冲液pH7.4 0.9%生理盐水 1.3.6.2.3 实验步骤 1.3.6.2.3.1 样品制备 溶血液：取鼠血10μl加入到1mL双蒸水中，充分振摇，使之全部溶血1:100待测，4h内测定酶活力。若当天来不及测定，将肝素抗凝全血置-20℃冻存，3d内测定，若4℃存放，28h内必须测完。测前取出样品室温自然解冻。 组织上清液：动物禁食过夜，处死后，立即取出所需脏器，放入冷生理盐水中洗去浮血，剔除脂肪及结缔组织，滤纸吸干后，在冰浴上剪成碎块，称取适量组织，加冷0.2M磷酸缓冲液，以20000r/min匀浆10s，间歇30s，反复3次制成5%组织匀浆，操作在冰浴中进行，匀浆以12500×g离心10min（低温高速离心机），以沉淀为破碎的细胞、细胞碎片、核及线粒体，上清液用以测胞液中的酶活力，最好当天测，否则加20％（v/v）-20－-80℃，可保存数周，而酶活力不减。 1.3.6.2.3.2 GSH标准曲线的制作： 取1.0mmol/LGSH溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分别置于10mL小容器瓶中，各加入偏磷酸沉淀剂8mL，用双蒸水稀释至10mL刻度，即得到浓度为0、20、40、60、80、100μmol/L的 GSH标准液。 取上述不同浓度标准液各2mL，放入试管中，加入0.32mol/L Na2HPO4 2.5mL，比色前加入DTNB显色液0.5mL用光径1cm杯，5min内在可见光423nm波长测OD值，以双蒸水调零点。 以GSH含量（μmol/L）为横坐标，OD423值为纵坐标，绘制标准曲线。 1.3.6.2.3.3 测定步骤： 试剂 样品管（mL） （mL） （mL） 1.0mmol/LGSH 0.4 0.4 ** 0.4 双蒸水* 0.4 37℃水浴预温5min H2O2（37） 0.2 0.2 373min （） 4 4 3000r/min离心10min 离心上清液 2 2 双蒸水 0.4 偏磷酸沉淀液 1.6 0.32mol/LNa2HPO4 2.5 2.5 2.5 DTNB显色液 0.5 0.5 0.5 显色反应1min后于423nm波长（1cm光径），读OD值，5min之内读数准确。 * 样品为组织上清液时，非酶管改为加热使酶失活的组织上清液。 **溶血液 0.1－0.4mL 组织上清液 1:20稀释，取稀释液0.4mL 注：如用试剂盒，可按试剂盒的操作要求进行。 1.3.6.2.3.4 计算 鼠全血GSH-Px活力单位 规定每1mL全血，每分钟，扣除非酶反应的log[GSH]降低后，使log[GSH]降低1