免疫组化原理及流程介绍_精品.pptVIP

免疫组化原理及流程介绍 实验分析的相关介绍 阳性对照： 用已知抗原阳性的切片与待检标本同时进行免疫细胞化学染色。对照切片呈阳性结果，标为阳性对照。 * 用确证不含已知抗原的标本作对照，应呈阴性结果，称阴性对照。其实这只是阴性对照中的一种，阴性对照还应包括空白、替代、吸收和抑制实验。 阴性对照： * 免疫组化原理及流程介绍 阳性对照 阴性对照 替代对照 实验 组 结论 1 － － － － 操作错误 2 ＋ ＋ ＋ ＋ 非特异性反应 3 ＋ ＋ － － 阴性对照含定位Ag 4 － － － ＋ 阴性对照不含定位Ag 5 ＋ － ＋ ＋ 受检组织非特异性染色 6 ＋ － － － 受检组织不含定位Ag 7 ＋ － － ＋ 受检组织含定位Ag 免疫组化染色实验组与对照组结果分析表 * 免疫组化原理及流程介绍 从表上可以看出，只有6，7实验结果有意义。1～5均因对照组的结果已否定Ab的特异性或因IHC技术操作存在错误等而使实验结果失去意义，必须重复实验或换用 Ab. 阳性对照 阴性对照 替代对照 实验 组 结论 6 ＋ － － － 受检组织不含定位Ag 7 ＋ － － ＋ 受检组织含定位Ag * 免疫组化原理及流程介绍 1．阳性染色特点 ① Ag定位，胞浆、胞核、胞膜、间质具有结构性。（非特异性染色 细胞与组织无区别） ② 染色强度不同：颜色深浅不一（非特异性染色 弥散性均匀）。 ★除上述对照结果分析之外，还必须从以下几个方面综合评价： * 2．组织切片制作过程的影响 ① 固定不良—非特异性染色，显示不均。 ② 边缘干燥—非特异性染色（常见），加抗体时勿干片。 免疫组化原理及流程介绍 3．人工假象与特异性结果显示不在同一 平面上。 * 免疫组化原理及流程介绍 ▲染色失败的几种原因： (1)所染的全部切片均为阴性结 果，包括阳性对照在内。 染色失败的可能情况 (2)所有切片均呈阳性反应 (3)所有切片背景过深 (4)阳性对照染色良好，检测的 阳性标本呈阴性反应 * 免疫组化原理及流程介绍 (1) 所有切片呈阴性 1）染色未完全严格按照操作步骤进行 2）漏加一种抗体，或抗体失活 3）缓冲液内含叠氮化钠，抑制了酶的活性 4）底物中所加H2O2 量少或失活 5）复染或脱水剂使用不当 * 免疫组化原理及流程介绍 ①切片在染色过程中抗体过浓，或干片了。 缓冲液配置中未加氯化钠和PH值不准确，洗涤不彻底。 使用已变色的呈色底物溶液，或呈色反应时间过长。 ④抗体温育的时间过长。 ⑤H2O2 浓度过高，呈色速度过快且粘 附剂太厚。 （2）所有切片呈阳性反应，其原因： * 免疫组化原理及流程介绍 （3）所有切片背景过深 ① 内源性过氧化酶没有完全阻断 ② 切片或涂片过厚 ③ 漂洗不够 ④ 底物呈色反应过久 ⑤ 蛋白质封闭不够或所用血清溶血 ⑥ 使用全血清抗体稀释不够 * 免疫组化原理及流程介绍 （4）阳性对照染色良好，检测的阳性标本呈阴性反应。 最常见的原因是： 标本的固定和处理不当 * 1.苏木素复染时间需要摸索，尤其要考虑阳性染色的位置。 2.切片脱蜡和水化要充分；加反应液时要覆盖组织充分；每次加 液前甩干洗涤液，但又防止干片 。 免疫组化原理及流程介绍 注意事项： * 3.以下原因可能导致片子着色不均匀： ① 脱蜡不充分。可以 60 ℃烤 20 min，立即放入新鲜的 二甲苯中； ② 水化不全。应经常配制新鲜的梯度乙醇； ③ 抗体没混匀。用移液器充分混匀一抗/二抗等试剂； ④ 抗体孵育时，切片放倾斜； ⑤ 抗体孵育后 PBS 冲洗不充分。 ⑥ 制片厚薄不均匀等问题。染片盒不平，切片倾斜。 免疫组化原理及流程介绍 * 4.一抗的清洗： 免疫组化原理及流程介绍 （1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。 （2）温柔冲洗，防止切片的脱落。推荐用浸洗方式； （3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。 * 5.PBS的PH和离子强度的使用。 免疫组化原理及流程介绍 建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。 中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解。 * 5.拍照 免疫组化原理及流程介绍 有条件的话最好立即拍照，若不能及时拍照，也要封好片和用指甲油封固，保持避光和湿度。 * 免疫组化原理及流程介绍 谢 谢 * 免疫组化的原理及流程介绍 主要内容 免疫组化原理及流程介绍 一.免疫组化的发展简史 二.免疫组化的原理 三.免疫组化的基本流程 四.免疫组化的结果分析 * 免疫组化原理及流程介绍 一.发展简史 1941年 Coons 首先用荧光