基因操作原理的理论基础.doc

第一章? 基因操作原理的理论基础 ?????????????????????????第一节 基因操作原理??? 基因操作（Gene Manipulation）的核心部分为分子克隆（molecular cloning）（ Principles of Gene Manipulation ，Black well Scientific Publications , RW. OLD SB Primrose , 1985）DNA） ????本课程就是为了讲述在核酸水平上对基因进行研究所涉及的方法、技术和策略的原理，主要是基本的、通用的原理，对于涉及到具体的学科或领域的原理不在此范围内。????基因操作原理在生物学科发展中具有重要地位。这门课以前叫“分子克隆Ⅰ”，Ⅱ”为实验课。但无论叫什么，本门课程到底要讲些什么，它的地位如何？????20 世纪是生物学发展最为迅速的时期， 1953 年由于认识了 DNA 的双螺旋结构，从而揭开了分子生物学研究的热潮。在整个生物学研究进程或研究层次来说，其发展过程涉及到个体、组织器官、细胞、亚细胞水平，同时由于遗传学的兴起与发展， DNA 作为生命遗传信息的物质基础被确定下来，从而导致分子生物学的诞生。????分子生物学严格来说应是从分子水平或核酸水平上进行研究的生物学，研究生物的生物学现象和本质，如DNA的结构、复制、表达、调控、遗传、变异等。由于分子生物学的进一步发展，生物学的各个分枝学科都延伸到了分子水平，在这种情况下，传统分子生物学就是一个包罗万象的学科，大的可以说动、植、微生物的分子生物学，小的可以说某些物种的分子生物学，如水稻的分子生物学、链霉菌的分子生物学、芽胞杆菌的分子生物学。????在这种情况下，传统的分子生物学就好象是高级生物化学，阐述基因或者说 DNA（核酸）的静态和动态化学本质。目前的分子生物学，朝着发育、结构和遗传生物学的方向发展。如果说传统的分子生物学是静态分子生物学的话，那么这些学科可以说是动态分子生物学，即在分子水平（核酸）上，研究生物的生长、分化、死亡以及遗传和变异的内在规律。????在以上这些研究中，均涉及在 DNA 水平的操作，本门课程就是要讲述这相关的原理，为分子生物学的研究服务。通过分子生物学内在的原理，如 DNA 结构、复制、转录、表达、调控等，讲述研究方法和技术的设计原理。 第二章? 分子克隆工具酶 ?????［本章摘要］?????限制和修饰现象在上个世纪中期被人们所发现，到?2005?年?1?月，已经发现 4342 种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有 3681 种。限制性内切酶有特定的识别位点和切割位点，切割后可产生平末端或粘性末端。酶切有标准的反应体系，受末端长度的影响，有位点偏爱性，在极端非标准条件下会产生星星活性。通过酶切连接可以增减酶切位点，酶切位点在基因组中的分布是不均匀的。大肠杆菌有三种甲基化酶和三种依赖于甲基化的限制系统。甲基化对限制酶切影响。基因操作常用的 DNA 聚合酶有大肠杆菌 DNA 聚合酶Ⅰ，T4、T7 DNA 聚合酶以及末端转移酶。为满足工作需要，还开发有 Klenow DNA 聚合酶，耐热 DNA 聚合酶以及反转录酶。除限制修饰酶和聚合酶以外，基因操作中还用到很多重要的酶，包括：连接酶、T4 多核苷酸激酶、碱性磷酸酶、核酸酶、琼脂糖酶、蛋白酶、溶菌酶以及一些 DNA 结合蛋白。 第一节 限制性内切酶Restriction and modification）1．限制与修饰现象??? 早在 50 年代初，有许多学者发现了限制与修饰现象，当时称作寄主控制的专一性（host controlled specificity）。 ( 噬菌体表现的现象便具有代表性和普遍性，其在不同宿主中的转染频率可说明这一问题（2-1） ( 在感染某一宿主后，再去感染其它宿主时会受到限制。 E.coli 菌株 λ噬菌体感染率 (K (B (C E.coli K 1 10-4 10-4 E.coli B 10-4 1 10-4 E.coli C 1 1 1 ?在 20 世纪 60 年代，人们就注意到 DNA 在感染宿主后会被降解的现象，从而提出限制性切酶和限制酶的概念。 1968 年，首次从 E.coli K 中分离到限制酶，它有特定的识别位点但没有特定的切割位点，其中切割位点离识别位点达 1000bp 以上。??? 1970 年，美国约翰·霍布金斯大学的 H. Smith 于偶然中发现，流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）能迅速降解外源的噬菌体 DNA ，其细胞提取液可降解 E.coli DNA ，但不能降解自身 DNA ，从而找到 HindⅡ 限制性内切酶。 HindⅡ 限制性内切酶位点和切割位点如