11 第十一讲2 dna序列分析.pptVIP

DNA序列分析 目前DNA测序的基本方法： 1 Maxam-Gilbert化学降解法 2 Sanger双脱氧链终止法 1 Maxam-Gilbert化学降解法 1.1 原理： 特定化学试剂可对不同碱基进行特异性修饰并在被修饰的碱基处打断磷酸二酯键，从而达到识别不同碱基种类的目的。 Maxam-Gilbert化学反应的化学试剂和化学反应 碱基体系 化学修饰试剂 化学反应 断裂部位 G A+G C+T C A＞C 硫酸二甲酯 哌啶甲酸，ph2.0 肼 肼+NaCL(1.5M)) 90℃,NaOH 甲基化 脱嘌呤 打开嘧啶环 打开胞嘧啶环 断裂反应 G G、A C、T C A、C 1.2 基本步骤 ⑴对待测DNA片段的5‘端磷酸基团作放射性标记； ⑵用化学修饰试剂修饰特定碱基，产生一段被标记的、起始位点相同的、不同长度和以不同碱基结尾的DNA片段群； ⑶凝胶电泳分离和放射性自显影。 2 Sanger双脱氧链终止法 2.1 原理 ddNTP（2‘，3’-双脱氧核苷三磷酸） dNTP （2‘-脱氧核苷三磷酸） 2.2 反应体系 ⑴标记的引物 ⑵待测序模板 ⑶DNA pol I ⑷dNTP ⑸ddNTP 注意：要求4个反应体系。 A：dNTP+ddATP C: dNTP+ddCTP G: dNTP+ddGTP T: dNTP+ddTTP 3 DNA的自动测序 Sanger双脱氧链终止法 缺点： ⑴需要4个反应体系； ⑵并列点样，电泳检测。 全自动测序基于Sanger原理，采用PCR测序模式。其核心技术在于用4中不同的罗丹明荧光染料分别标记4种双脱氧核苷酸。 这4种荧光染料可激发出不同颜色的荧光，因此链终止反应可以在同一个试管中进行并在同一个泳道中检测。 产物在聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳中按相差1个核苷酸大小的DNA片段长度顺序向下泳动，当到达检测器时，激光探测仪发出激光，激发荧光染料标记的DNA片段末端碱基发出荧光。 一般来说，同位素标记的测序可读出200—300个核苷酸序列，而荧光标记测序可读出500—800个核苷酸序列。 4 DNA的测序策略 4.1 定向测序策略 4.2 随机测序策略 4.3 多路测序策略 4.4 引物步移策略 随机测序策略 鸟枪法(shotgun) 将待测DNA片段随机打断并构建随机重叠克隆文库，然后通过通用引物测定每个克隆子的末端序列，最后进行拼接。 引物步移策略 引物步移动(primer walking)： 在待测DNA片段中，如果知道部分核苷酸序列，可根据该已知序列设计引物来测定其相邻部位的序列，并依次类推。 思考题： DNA序列分析的方法有哪些？