应用HU6双启动子RNAi载体筛选人泛素结合酶hUBE2W的RNAi.PDFVIP

生 物 工 程 学 报 Chin J Biotech 2008, November 25; 24(11): 1975-1980 Chinese Journal of Biotechnology ISSN 1000-3061 cjb@ © 2008 Institute of Microbiology, CAS CSM, All rights reserved 研究简报 应用H1-U6 双启动子RNAi 载体筛选人泛素结合酶 hUBE2W 的RNAi 有效靶点 * * 张莹莹, 李朝 , 杨志新, 许龙, 朱恒奇, 周晓巍, 黄培堂 军事医学科学院生物工程研究所, 北京 100071 摘 要: hUBE2W 是新近鉴定出的一种I 型泛素结合酶, 可能在肿瘤发生和DNA 损伤修复过程中起重要作用。RNA 干 涉是指通过形成局部双链 RNA 进而特异性地降解细胞内同源基因 mRNA 的机制, 目前已成为基因功能研究的有力工 具。通过构建 H1-U6 双启动子 RNAi 载体, 可以在体内直接转录出针对 hUbe2w 基因的两段互补小 RNA, 更接近于生 理状态下小干涉 RNA 的作用。利用RT-PCR 方法从293FT 细胞总RNA 中扩增出hUbe2w 基因, 分别将其连接至质粒 pGL3-Control 、pCMV-myc 和pDsRed-express-C1 中, 以便在mRNA 水平和蛋白水平检测RNA 干涉效果。RNA 干涉载 体分别与上述报告载体共转染 293FT 细胞, 测定萤光素酶活性和hUBE2W 蛋白表达水平, 结果显示靶点 125 和259 能 够在mRNA 水平和蛋白质水平显著降低hUbe2w 的表达。 关键词: 泛素结合酶, hUBE2W, RNA 干涉 Selecting Functional siRNA Target Sites of hUBE2W Based on H1-U6 Dual Promoter RNAi Plasmid Yingying Zhang, Chao Li, Zhixin Yang, Long Xu, Hengqi Zhu, Xiaowei Zhou, and Peitang Huang Beijing Institute of Biotechnology, The Academy of Military Sciences, Beijing 100071, China Abstract: hUBEW, a newly identified class I ubiquitin conjugating enzyme, probably plays an important role in tumorigenesis and DNA repair processes. RNA interference (RNAi) is a process in cells to degrade specific homologous mRNA by forming duplex RNA and has been developed into a powerful tool to study gene functions. In this study, the H1-U6 dual promoter RNAi plasmid was cons