细菌视紫红质E204Q和1119T／T121S／A126T.PDFVIP

2005;32(6) 生物化学与生物物理进展 Prog.Biochem.Biophys. ·529 · 细菌视紫红质E204Q和1119T/T121S/A126T 突变体的构建及其功能研究* 宋景娇，‘钟 声”张悦”曹军卫**)‘胡坤生’**) )’(武汉大学生命科学学院，武汉430072;n中国科学院生物物理研究所，北京100101) 摘要 应用定点突变的方法获得了细菌视紫红质(bacteriorhodopsin,BR)的单突变体BRA〕和三突变体 BRIUVrrn2iani2sr.通过功能研究发现，BR蛋白的单突变体BRA 的M态寿命为7.10ms，三突变体BRninnn2isni2sr的 M态寿命为8.23ms，均较野生型BR蛋白(6.23ms)有所延长，三突变体表现得更为显著，其M态延长时间可超 出野生型的32.同时单突变体BRA 和三突变体BRnigrin2is%v2sr的质子泵功能也均有改变，都比野生型BR蛋白 有所下降，其中三突变体BRnlVrin2lS/AI26r下降得更为明显. 关键词 细菌视紫红质，突变体，M态中间体，质子泵功能 学科分类号 093 细菌视紫红质((bacteriorhodopsin,BR)是存在 突变得到BR蛋白的三突变体BRnirnriz1snizcr也被证 于嗜盐菌盐沼盐杆菌毋alobactriumsalinarium)紫膜 明了具有长寿命的O态[[3] 上唯一的蛋白质，分子质量约为26ku.每个BR分 长寿命的O态可能会导致BR蛋白回到基态的 子由含248个氨基酸残基的单一肤链和一个视黄醛 时间延长，从而有可能导致M态的寿命也随之延 分子组成，肤链在质膜上卷曲折叠形成7个跨膜螺 长4[[1.所以我们构建单突变体BRA 和三突变体 旋，视黄醛分子通过质子化的希夫碱基结合到BR BRuivririzis%uzsr，以研究这些突变体对BR蛋白M态 蛋白G螺旋第216位赖氨酸的s氨基上.在吸收光 寿命和质子泵功能的影响. 子后，BR将质子泵出细胞外，在细胞膜两侧形成 1材料和方法 质子梯度，质膜上的ATP合成酶利用质子梯度合 成ATP.BR分子在完成质子泵功能的同时，伴随 1.1材料 着一个光循环的过程，视黄醛的异构化在光循环中 1.1.1菌株和野生型BR蛋白.BR蛋白表达缺陷型 起着关键的作用，BR分子被光激发后，通过热弛 菌株— 盐沼盐杆菌(Halobactriumsalinarium)L33 豫，经历视黄醛构型为13一顺式的K,L,M,N (bop基因中插入ISHZ)[51由浙江大学吴敏教授赠予. 态和全反式的O态的转变，最后返回到具有全反 大肠杆菌(Escherichiacoli)DH5a(武汉大学生命科 式视黄醛构型的基态，从而完成一个光循环过程m[ 学学院保存).野生型BR蛋白由中国科学院生物物 O态也可通过P态和Q态完成一分支光循环. 理研究所胡坤生教授提供. M态是天然BR分子光循环中一个很重要的中 1.1.2基因和载体.质粒pUCMB-bop(在PUC质粒 间态，其吸收峰波长在412nn ，与光适应BR基 上连接有1.2kb的DNA片段，包含有bop基因及 态吸收峰波长568mm 相距很远，故可以利用M态 启动子6[[]，此片段两端分别含有BamHI和HindIQ 与基态互变的光致变色特性进行信息处理和存储. 酶切位点)，表达载体pXLNovR(大肠杆菌与嗜盐 但是天然BR蛋白的M态寿命为ms数量级，远不 菌的穿梭质粒，约 13kb，在大肠杆菌中表现为四 能满足信息存储应用的需要.因此，必须设法延长 M态的寿命.提高M态的寿命有很多方法2[[]，其中 *中国科学院知识创新工程重大项目(KJCXI-swo7)和国家自然科 最直接有效的方法是基因修饰[[3] 学基金资助项目. 国外研究表明，通过定点突变得到BR蛋白的 **通讯联系人. 单突变体BRA 与野生型BR分子相比，O态的形 曹军卫，Tel