第五章 生化实验.pptVIP

* * ? 一 与蛋白质、氨基酸和其他含氮化合物的反应 (包括蛋白水解活性试验) 在生化实验中，通常应通过使用已知细菌的菌株做阳性对照可以检测每批培养基是否合格。 在每次试验中都应用一个没有接种的试管或培养皿作为对照，检测因培养基或试剂不纯或变质而导致假阳性反应。 1 明胶的水解作用 (1)营养明胶 培养基：在营养肉汤中加入10％～15％的明胶，调节pH至7.2，115℃高压灭菌20min 在装有营养明胶的试管中穿刺接种，于20—25℃培养30d，若菌种在25℃生长不好，应将试管放在最合适的温度下培养。 结果记录：如果空白对照试管仍是固态而测试培养基被液化，则表明发生了水解作用，记录下明胶液化的程度和形状。如果试管在高于25℃进行培养，在检查是否发生水解之前，要将培养物在冰水中浸泡5 min。 第五章 菌种鉴定的生化试验 (2)Frazier明胶琼脂(改良型) 培养基： 在营养琼脂中加入0.4％明胶，调节pH至7.2，110 ℃高压灭菌20min。 在已倒好干燥培养基的平皿上划线接种或点接种。在最佳生长温度下培养2—14d。 试剂：1％盐酸。 记录结果：用8～10mL试剂充满培养皿，没有水解的明胶与试剂慢慢形成不透明的白色沉淀，水解的明胶部分呈现了一个清晰的环带。以毫米为单位记录从菌落边缘到环带边缘的清晰带的大小。 培养基：牛乳琼脂。由琼脂和10％的脱脂牛乳组成，115℃高压灭菌20rain。 在倾倒平板前与10mL加热灭菌的2.5％琼脂水溶液和5mL加热灭菌的脱脂牛乳(30％牛乳琼脂)迅速混合就可制成不透明的牛乳琼脂培养基。这种培养基最好使用双层平板，即在平皿中预先倒10mL琼脂水溶液，放置。然后薄薄地覆盖一层30％牛乳琼脂。 在已倒好干燥培养基的平皿上划线接种，在最佳生长温度培养2～14d 试剂：1％盐酸或1％单宁酸溶液； 结果记录：平板培养后出现的清晰环带证明发生了酪蛋白水解。 但可能会有假阳性结果；为了验证清晰环带是否是酪蛋白水解的结果，用1％的盐酸溶液铺满平皿，盐酸溶液是蛋白质沉淀剂。以毫米为单位记录清晰环带宽度 。 2 酪蛋白的水解作用 培养基：Loeffer血清。由3份血清加1份葡萄糖营养肉汤组成。这种培养基在制备时的要求温度相对较低，葡萄糖营养肉汤应先高压灭菌，在灭菌三角瓶中与灭菌血清混合，将配制好的培养基无菌分装到灭菌的螺帽小瓶(5mL)中。缓慢加热到85℃，并摆放成斜面 。培养基在85℃灭菌20min，连续3d，每天1次。 用常规方法在血清斜面上划线接种，在最佳生长温度培养2—14d。 结果记录：可目视检查凝固血清是否发生了水解(液化)作用。 3 凝固血清水解实验 培养基：将胰蛋白胨水(胰蛋白胨1％-2％，NaCl 0．5％，最终的pH为7．2)分装于试管中，每管5mL，121℃高压灭菌15min(胰蛋白胨中色氨酸含量很丰富 )。接种液体培养基，最好选用琼脂斜面上的幼龄菌株，于最佳生长温度培养2—7d 试剂： 使用Kovacs试剂 结果记录：加0.5mLKovacs吲哚试剂，轻轻摇动试管，然后使其静置。色氨酸代谢后能产生吲哚，3—甲基吲哚(甲基吲哚)或吲哚乙酸。如有吲哚产生，乙醇层为深红色。试管下层为红色或粉色(透明)则表明有3—甲基吲哚产生。只有最上层出现红色或粉色时才会被记录为吲哚试验阳性。 4 分解色氨酸产生吲哚 (1)蛋白胨水 接种一管蛋白胨水(1％蛋白胨，0．5％氯化钠)和一管无菌空白对照，在最佳生长温度下培养2—7d 试剂：Nessler试剂。 结果记录：在载玻片或釉面瓷片上将一接种环培养物加入到一环的Nessler试剂中，或在一个干净试管中加入lmL培养物和lmLNessler试剂。出现橙色或褐色表明有氨生成。同时检测已灭菌的对照管，对照管应呈现浅黄色或无颜色反应。 (2)精氨酸肉汤 该培养基主要用于链球菌的鉴定。在精氨酸肉汤试管中接种后，与一个已灭菌的对照试管在最佳生长温度一起培养2—7d。 试剂和结果记录：同方法1(蛋白胨水)。 5 分解蛋白胨或精氨酸产生氨 (3)Thornley半固体精氨酸培养基 该培养基以酚红作为p