第6章 分子生物学研究法(下）.pptVIP

检测方法 FISH的是用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。 与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点 目前这项技术已经广泛应用于动植物基因组结构研究、染色体精细结构变异分析、病毒感染分析、人类产前诊断、肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。 非定点突变 （1）易错PCR技术为代表的无性进化 （2）DNA改组技术为代表的有性进化 基因打靶的必备条件 打靶需要两个必备条件：一是子弹，二是靶子。同样的，基因打靶也需要其必备条件：一是要有将外源基因导入宿主细胞的载体；另一种就是能接受外源基因的受体（常用的是胚胎干细胞） 打靶载体（targeting vector） 通常，我们将外源基因DNA片段通过相应载体导入ES细胞中。一个好的载体应具备以下特点： ①能在宿主细胞中稳定存在； ②具有一个以上的遗传标志， 胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES） ES细胞是取自小鼠胚胎早期的内细胞团。ES 细胞的特点：能在体外培养，并保留发育的全能性。 因此，在体外进行遗传操作后，将它重新植回胚泡，它就可以发育成胚胎的各种组织，将胚胎移植入母鼠子宫内，使ES细胞有机会发育成小鼠或某种组织。 一般认为，基因的同源重组只发生在一条染色体上，当一条染色体上的同源基因被同源顺序置换后，另一条染色体上的等位基因不再发生置换，因此，经同源重组后只能得到嵌合体小鼠（chimeric mouse）。 然后经过杂交育种，按孟德尔遗传规律，其后代中有四分之一的几率为纯和子，这样经过将嵌合体小鼠和正常小鼠进行交配，就可以得到基因敲除的纯系小鼠，即基因 敲除小鼠。 RNAi技术的优缺点 RNAi最根本的特点是特异性 RNAi具有特殊的穿越能力,如将双链RNA注射在线虫性腺里,它也会干扰到体细胞里的基因表达,而且干扰作用会传给后代; RNAi对一些低水平表达的基因的RNAi现象并不明显,而且几个有相同或相似序列的基因, RNAi也会同时作用与它们. 反义RNA 反义RNA是由基因的负链编码,可与正义RNA (sense RNA)或DNA 编码顺序结合,干扰mRNA 的转录,加工和转运,调控基因的表达. 构建反义RNA 表达载体: 将全目的基因或部分目的基因反向插入表达载体 → 转化目标生物 →获得转基因个体或品系 → 分析转基因植株在生理、生化、形态等方面的变异 → 判别目的基因的功能 反义RNA 作用机理： A 干扰翻译的起始与延伸，可与翻译起始顺序及编码序列结合形成双链RNA，随之被细胞降解。 B 与mRNA 的引导顺序结合，阻止核糖体的附着，使翻译无法启动。 C 反义RNA与mRNA形成双链分子后，使RNA多聚酶脱离模板,转录终止。 基本原理: 构建与靶基因同源 (10～15kb)的载体 外显子插有新霉素抗性基因 （neor）作为正选择的标志 疱疹病毒胸苷激酶(HSV-tk)基因作为负选择 体外培养 新霉素(G418)和致死核苷类似物(GANC)作双重筛选 将重组体导入ES细胞 存活的ES细胞 方法 表型分析 构建载体 同源重组 筛选X被敲除的ES细胞 显微注射 回交得到X被敲除的动物 2、条件型基因敲除 条件型基因剔除是指某一特定细胞类型或细胞发育的特定阶段剔除某一特定基因的技术。 常用的条件型基因敲除有： 噬菌体的Cre/Loxp系统、Gin/Gix系统 酵母细胞的FLP/FRT系统、R/RS系统 构建打靶载体 同源重组 筛选中靶ES 显微注射 杂交删除neor基因 特定阶段诱导Cre酶 切除目的片段 动物观察分析 Cre-loxP 重组系统进行条件性基因剔除的程序： 体外培养 基因敲除技术的应用 1、研究基因调控和基因功能； 2、建立人类疾病的转基因动物模型，为医学研究提供材料； 3、改造动物基因型，鉴定新基因和/或其新功能，研究发育生物学； 4、治疗遗传病，即基因治疗。 5、改造生物、培育新的生物品种。 6.3.1 酵母单杂交法 酵母单杂交（yeast one－hybrid system)是一项常用于研究DNA与蛋白之间的相互作用的方法。 特点：通过该方法可以识别稳定结合于DNA上的蛋白质，可在酵母细胞内研究真核生物DNA与蛋白之间的相互作用，并通过筛选DNA文库直接获得靶序列相互作用蛋白的编码基因。 6.3 蛋白质及其RNA相互作用技术 转录激活结构域 （activation domain，AD） DNA