现代分离技术——高效液相色谱(HPLC)课件.pptVIP

目 录 一、高效液相色谱仪简介 二、键合相色谱法 三、亲和色谱法 四、体积排阻色谱法 五、建立高效液相色谱分析方法的一般 步骤 3、流动相的离子强度影响 考察不同离子强度的流动相对云芝多糖在Ultrahydrogel - line 柱上的吸附影响情况 当盐浓度在50 mmol/ L NaNO3 时分离效果较好, 继续降低盐浓度, 峰面积虽然增大但分离效果变差。故最佳离子强度盐浓度为50 mmol/ L NaNO3 4、校正曲线制作??? 配制系列窄分布Pullulan 多糖标样, 其浓度与样品浓度一致, Mr 分别为12. 5 ×105 、8. 50 ×105 、5. 01 ×105 、1. 56 ×105 、6 ×104 、2. 85 ×104 。在相应的色谱条件下得到校正曲线，计算出 曲线拟合公式 5、云芝多糖各组分相对分子质量测定??? 根据GPC 校正曲线及云芝多糖色谱流出峰，可计算云芝多糖各流出组分的数均相对分子质量和重均相对分子质量。 第五节、建立高效液相色谱分析方法的一般步骤 一、样品的性质及柱分离模式的选择 1、样品的溶解度 非极性化合物：吸附、正相分配、正相键合相色谱 极性化合物：反相分配、反相键合相色谱 水溶性样品： pH为中性：非离子型化合物，反相键合相色谱 pH为弱酸性：流动相中加入硫酸或磷酸，再用反相键合相色谱分析 pH为弱碱性：流动相中加入阳离子型反离子，再用离子对色谱法进行分析 pH为强酸、碱性：离子对色谱法 2、样品的分子量范围 脂溶性样品： 分子量2000且分子量差别不大 非离子型：吸附或键合相色谱 离子型：离子对色谱法 分子量2000且分子量差别很大：刚性凝胶的凝胶渗透色谱法或键合相色谱法 分子量2000：聚苯乙烯凝胶的凝胶渗透色谱法 （5）共价配位体 三、流动相 1、非选择性洗脱法 2、特殊洗脱法 第四节、体积排阻色谱 体积排阻色谱 凝胶过滤色谱 GFC 凝胶渗透色谱 GPC 一、分离原理 1、分布系数KD 2、溶质容量因子KD’ 凝胶渗透极限：KD=1.0，凝胶固定相所有孔洞均能接受样品分子 凝胶排阻极限：KD=0，凝胶固定相所有孔洞均不能使样品分子进入 因此在SEC中，不同尺寸样品分子的分布系数总是保持在0-1之间。 以所分离样品的分子量（M）和组分从柱中洗脱时的洗脱体积VC绘制校正曲线 3、SEC的分离特点 （1）、洗脱体积位于V0至V0+VP之间，因此色谱柱的峰容量是有限的，一般只能容纳10-12个色谱峰 （2）、不能用于分子大小组成相似，或分子大小仅差10%的组分分析 二、固定相 1、固定相的分类 （1）软质凝胶 Sephadex，Sepharose，Bio-Gel A、P等系列，常用于中、低压色谱，不适用于高柱压。 （2）半刚性凝胶 Styragel，NGX系列，聚苯乙烯凝胶，适合有机溶剂做流动相，可承受至少10MPa的柱压 （3）刚性凝胶 多孔球形硅胶 羟基化聚醚多孔微球 如TSK系列 2、凝胶固定相的特性参数 （1）渗透极限 凝胶可用来分离化合物分子量的最大值，超过此极限，高分子量化合物都从凝胶颗粒间的空隙处流出，而无分离效果。市售凝胶均由渗透极限大小确定产品规格。 （2）分离范围 lgM-VC校正曲线的线性部分。实际使用中可串联两到三根不同规格的凝胶柱，以扩充其分离范围。 三、流动相 体积排阻色谱法中，样品的分离与样品、流动相之间的相互作用无关，因而无需采用改变流动相组成来改善分离度。 选择流动相时应注意： 1、凝胶渗透色谱的流动相 续表 2、凝胶过滤色谱的流动相 使用以水为基体的具有不同pH值的缓冲溶液为流动相 （1）常加入无机盐如氯化钠、氯化钾、氯化铵等以消除吸附作用及基体疏水作用 （2）当需洗脱生物大分子蛋白质时，可加入离液序列试剂，如盐酸胍、聚乙二醇、脲、十二烷基磺酸钠等。 四、凝胶的实验技术（附） 1、凝胶的选择?? 根据所需凝胶体积，估计所需干胶的量。 一般葡聚糖凝胶吸水后的凝胶体积约为其吸水量的2倍，例如Sephadex G-200的吸水量为20，1 克Sephadex G-200吸水后形成的凝胶体积约40ml。凝胶的粒度也可影响层析分离效果。粒度细胞分离效果好，但阻力大，流速慢。一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快 2、凝胶的制备 商品凝胶是干燥的颗粒使用前需直接在欲使用的洗脱液中膨胀。为了加速膨胀，可用加热法，即在沸水浴中将湿凝胶逐渐升温至近沸，这样可大大中速膨胀，通常在1-2小时内即可完成。特别是在使用软胶时， 自然膨胀需24小时至数天，而用加热法在几小时内就可