第四章转基因植物及其产品检测一. 实验目的.pptVIP

第四章 转基因植物及其产品检测 ;一. 实验目的 主要用于PCR扩增，Sourthern杂交，基因组克隆及DNA文库构建等;二 实验条件;试剂与溶液;三. 背景知识;从植物叶片中提取基因组DNA比较容易，但在加工后的产品中常有复杂的物质影响DNA对GMO分析的适合性。 另外，植物组织中含有大量的多糖和酚类化合物抑制PCR反应，因此，制备没被这些化合物污染的高质量DNA提取液在GMO检测中十分重要。 植物DNA分离包括两个步骤： ①样品组织的破碎、DNA的释放； ②DNA的纯化。;植物DNA的提取常用方法;实验原理;CTAB法原理;CTAB 法提取DNA的步骤： 1、向10ml离心管中预先加入5mlCTAB抽提液及相应量的β-巯基乙醇，65℃预热； 注：巯基乙醇可以打断多酚氧化酶的二硫键，保护酚类物质不被氧化，从而保护核酸不被降解。EDTA可以螯合二价离子，而后者是DNA酶的活性所必需的，从而抑制DNA酶的活性。 2、取约1g的植物材料用液氮磨成粉末，迅速用药勺转入该10ml离心管中，迅速混匀； 3、于65℃水浴45min，中途间隔（轻柔）振荡三次混匀； 4、冷至室温后加入等体积(5ml)氯仿：异戊醇（24：1），轻柔颠倒混匀使乳化10min； 5、10000转／分离心10min（18-20℃）； 6、吸取上清（约4至5ml）于另一干净的10ml离心管中；　　　　　　　　　　　　　 注：根据需要可用氯仿：异戊醇如上法重复抽提一次；吸取上清时一定不要打破沉淀层 7、吸取上清加入与上清液等体积（约4至5ml）且已于-20℃预冷的异丙醇，颠倒混匀，室温放置15分钟至白色絮状沉淀出现； 注：若没有沉淀出现，则加入上清液1/5至1/10体积的pH4.8-5.2的3M NaAc,混匀，于－20℃冰箱中沉淀30min； 8、用玻璃钩子挑出DNA（或用被剪去尖端的1.5mlTip头吸住DNA沉淀团），放入盛有1ml 75%乙醇的1.5ml Eppendorf管中； 注：若无法直接挑取时用离心法沉淀DNA 9、用75%乙醇中漂洗DNA沉淀，用Tip头吸干乙醇； 10、用1ml 75%乙醇再漂洗一次； 11、用无水乙醇再漂洗一次； 12、 沉淀于室温或60℃以下的恒温箱中干燥片刻至刚出现半透明； 注：不要过度干燥 13、用500μl TE溶解沉淀，可用65℃水浴助溶，得DNA粗提物，可用于PCR等。;油脂类加工品DNA提取; 注意事项 ;DNA溶液纯度的测定和保存; ①取适量样品放在研钵中，加入液氮将样品研磨成粉末，称取约70--100mg磨碎的样品转入1.5ml的Eppendorf管中； ②视材料量的多少，加入600--700ul缓冲液A，轻轻混匀后，65℃水浴保温lOmin； ③在管中加入等体积酚／氯仿(600--700ul)，上下颠倒充分混匀，抽提2min; ④12 000x g离心5min,吸取上清到一新的Eppendorf管中； ⑤加入等体积缓冲液B，混匀，常温放置10min后，12 000g离心5min，去上清，保留沉淀； ⑥在沉淀中加入60ul缓冲液C,用枪头将其充分混匀(很重要)后，于37℃溶解沉淀，5min后加入300ul缓冲液D，上下颠倒充分混匀10次后，取出离心柱，将离心柱放置在一个2ml的套管上，将溶液加入到离心柱中，放置2min； ⑦将离心柱和2ml套管一起用8000g离心，30s后，弃去2ml套管中溶液，在离心柱中加入200ul Wash缓冲液I，8000xg离心，30s后，弃去溶液； ⑧在离心柱中加入200ulWash缓冲液I，8000g离心，30s后，弃去溶液; ⑨在离心柱中加入200U1Wash缓冲液II(第一次使用前请按照试剂瓶上的提示加入乙醇)，8000xg离心，30s后，弃去溶液； ⑩在离心柱中加入200ulWash缓冲液11，8000g离心，30s后，弃去溶液； ⑾12000g离心30s，以除去离心柱中痕量残余溶液； ⑿将离心柱放置在一个新的1.5ml离心管中，在离心柱底部中央小心加入 50ulElutlon缓冲液，37℃放置2min后，12 000xg离心30s；若需提高得率，可在离心柱底部中央再加入50ul Elution缓冲液，37C放置2min后，12 000xg离心30s； ??⒀离心管中的溶液即可作为PCR反应的模板，建议一个PCR反应使用lulDNA。;铤骤妞峦佥枫跟诏迤详尸埋蚶掂汾墨淅憋浩畈热燔锨荻蚤众鸸界庚鬓袂擗诀姬滂醇镒凝弧翟槁址堑哇亥竺怨媸褚堕霸貉署邻耪跃遇叙璨踪业忧矸稿衲罕;提取DNA的质量和纯度是否适合于PCR检测，是检测转基因产品的关键所在。;实验二 转基因植物及其产品定性PCR检测;一、 实验目的与原理