研究生 基因工程教学教材.ppt

DNA体外重组技术;重组DNA技术的发展史;重组DNA理论和技术准备;重组DNA技术的发展（1973-）;1973年Cohen重组DNA实验示意图;1977年Sanger等创造了双脱氧链末端终止法测定DNA序列，同时美国Maxam和Gilbert 发明了化学裂解法。 1978年，人类基因文库建立。 1981年Cech T 和 Altman 从四膜虫中发现具有催化活性RNA，称为核酶(Ribozyme) 1989年获诺贝尔化学奖。;DNA重组的有关概念;基因工程(genetic engineering)： 有目的地通过分子克隆技术，人为地操作 改造基因，改变生物遗传性状的系列过程。 分子克隆技术是基因工程的核心;理论上的三大发现：;技术上的突破：;基因工程的基本过程;将重组分子导入受体细胞（细菌）:K-12 带有重组子的细菌扩增，获得大量的繁殖群体； 筛选：从大量的细胞繁殖群体中筛选出带有重组DNA分子的克隆； 分析和表达：将选出的细胞克隆的目的基因进行进一步分析并实现功能蛋白的表达。;基因工程在医药学中的应用;工具酶;限制性核酸内切酶 (restriction endonuclease , RE);作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统,限制外源DNA,保护自身DNA。;Ⅱ型酶作用特点： 只有限制性活性，无甲基化活性； 只需Mg++作为催化反应辅助因子，无须ＡＴＰ 能精确识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割，以内切方式水解双链DNA中的磷酸二酯键，产生DNA片段5’为磷酸基，3’为羟基。;Ⅱ类酶识别序列特点—— 回文结构 ;Ⅱ型酶切割dsDNA产生3种不同的切口： 5`突出端: EcoRⅠ 5’--G↓AATTC--3’ 3’--CTTAA↑G--5’ 3`突出端: PstⅠ 5’--CTGCA↓G--3’ 3’--G↑ACGTC--5’ 平末端: SmalⅠ 5’--CCC↓GGG--3’ 3’--GGG↑CCC--5’;反应条件 缓冲液: Mg2+ 、Na+、 K+、 BSA(明胶)、　　　　　　Tris.Hcl(pH7.2-7.6) 反应体积：10-50?l 反应温度: 370C, 30-60 时间: 越短越好，２小时或以上 影响内切酶正常活性的常见因素 DNA样品不纯:酚、氯仿、SDS 甘油太高：超过５％ 　　缓冲液选择不当：双酶切; 同裂酶（同功异源酶）:不同细菌来源的酶，能识别和切割同一位点。 MboI-Sau3A: 5’ GATC 3’ 同尾酶: 产生相同粘性末端的不同来源的酶。 　 BamHI-Sau3A: 5’ GGATCC 3’ 可变酶:　识别序列中一个或几个碱基可变 　 BstpI: 5’ GGTNACC 3’;DNA连接酶（DNA Ligase）;主要功能：催化两个独立双链DNA片段5’-磷酸基和3’-羟基之间形成磷酸二酯键；修复双链DNA中一条链上的缺口。 底物：两个不同片段的双链DNA间存在互补粘性末端；一条带缺口的双链DNA分子, 两个双链DNA分子间平末端。 ;DNA聚合酶（DNA Polymerase）;5’? 3’外切酶活性：能从游离的5’-P末端降解双链或单链DNA成为单核苷酸。 3’? 5’外切酶活性：能从游离的3’-OH末端降解双链或单链DNA成为单核苷酸。校正活性（proof-reading） ;应用 催化DNA缺口平移（nick translation）反应，制备高比活DNA探针； 　5’-3’ DNA聚合酶，5’-3’核酸外切酶 第二cDNA链合成：类似＂缺口平移＂； 对双链DNA3’突出末端进行末端标记； 5’-3’ DNA聚合酶，3’-5’核酸外切酶 Sanger 测序 ;5‘;2、大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰklenow片段;双链DNA;Taq DNA聚合酶;逆转录酶 （reverse transcriptase）;AMV　逆转录酶 (Avian myeloblastosis virus) 禽类成骨细胞性白血病病毒;末端脱氧核糖核酸转移酶（TdT）:将dNTP加到DNA3’羟基。 3’端标记DNA探针 在载体和待克隆片段上形成同聚物尾，以利DNA重组。 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase）： 催化去除DNA、RNA、NTP及dNTP的5’磷酸基团。 在用32P标记5’末端前，去除DNA或RNA的5’磷酸基； 在连接反应中，去除载体DNA片段5’磷酸基，防止自身环化。;依赖于DNA的RNA聚合酶 ;常用载体;载体(Vector);最