【医学实验】禽流感病毒的鸡胚培养法.pptVIP

* * 血凝原理 血凝抑制原理 * 实验材料及器械 1. 收获的尿囊液（即流感病毒） 2. 1%鸡红血球、0.85％生理盐水 3. 血凝板、吸管、三角瓶 * 实验方法及步骤 1. 第1孔加入0.4ml尿囊液，第2孔加入0.1ml 尿囊液。 2. 吸取0.9ml生理盐水于血凝板第2孔，从第3孔至第10孔每孔各加生理盐水0.4ml。 3. 反复吹打3～4次第2孔，从混匀的第2孔中丢弃0.2ml，吸取0.4ml至第3孔混匀，再吸0.4ml至第4孔，依次稀释到第9孔，第9孔经稀释吹打后吸出0.4ml， * 弃去，第10孔为血球对照，即不加尿囊液。 以上各孔（从第1孔到第10孔）的病毒的稀释度分别为： 孔数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 稀释度 病毒原液 1：10 1：20 1：40 1：80 1：160 1：320 1：640 1：1280 空白对照 注意：各孔内液体量应为0.4ml * 4. 从第10孔开始，按10-1的方向，向每孔加0.4ml 1％鸡红血球，轻轻振荡均匀，置室温45分钟后观察实验结果并记录，各孔的总体积应为0.8ml。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 病毒原液 红细胞对照 依次加入0.4ml 1％鸡红血球 * 实验结果判断 血凝结果以++++、+++、++、+、－表示。 红细胞均匀分布于孔底者为++++； 红细胞均匀分布于孔底，但有卷边现象为+++，即不完全凝集； 红细胞在孔底形成一个中等大小环状，四周和中心有凝集以两个加号++表示。 红细胞在孔底形成一个小团，边缘光滑圆润者为－，红细胞完全未被凝集； * * 实验中应注意的一些问题 1. 实验所使用的玻璃器材及有机玻璃板均应干净，血凝板使用完毕及时处理，避免残留的酸、碱和沉着的红细胞影响实验结果 2. 流感病毒是对温度比较敏感的病毒，标本置于－20℃时在一两个星期内会出现病毒效价减少的现象，一般需要在－70 ℃存放。 3. 一般采取公鸡的红细胞，而且存放时间超过一周就不可再用。红细胞采来后用PBS洗3到4遍，直到上清很清亮，放置后如果上清变红，说明有溶血，则不可再用。 * 4. 温度、反应时间、反应体系对血凝试验的结果影响都很大。温度过高病毒毒力过强会出现溶血，不利于判定。反应的时间不能太长，对照孔出现沉淀就可以判定。 * 思考问题 加病毒液和红细胞悬液时为什么要反向加？ 血凝试验设置空白对照的意义？ 病毒悬液为什么采取倍比稀释而不是更高倍数如十倍比稀释？ * 鸡胚原代细胞培养及流感病毒感染细胞的红细胞吸附 * * 原代培养期： 　　也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一般持续1一4周。 细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛 原代培养细胞与供体组织在形态结构和功能活动上相似性大 细胞群是异质的，也即各细胞的遗传性状互不相同 细胞相互依存性强，细胞独立生存性差 原代培养细胞呈二倍体核型 * 传代期：　　原代培养细胞一经传代后便改称做细胞系。 在全生命期中此期的持续时间最长 细胞增殖旺盛，大多能维持二倍体核型 为保持二倍体细胞性质，细胞应在原代培养期或传代期早期冻存。反复传代就有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化 * 衰退期： 一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期衰退期。 　　细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖，最后衰退凋亡。 * 在传代末或衰退早期，由于多种因素的影响，部分细胞可能发生转化 转化的标志之一是细胞可能获得永生性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系，也称连续细胞系 细胞获不死性后，核型大多变成异倍体 * 常规细胞实验用品： 超净工作台，压力蒸汽消毒器，电热干燥箱，滤器，酸缸 CO2培养箱 倒置显微镜 酶标仪、微孔板震荡器 液氮罐 自动双重纯水蒸馏器，纯水仪 耗材：培养瓶，吸管，电动吸引器，培养板， 冻存管 * 原代培养的过程 取材 培养材料的制备 接种 加培养液 培养 * 准备工作： A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装、灭菌 B. 工作台面、工作环境的消毒 C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦 拭消毒，穿工作衣，戴帽、