酵母抽提物滋味物质分析.pptVIP

4. 还原糖的测定 4.1 实验原理 DNS（3,5-二硝基水杨酸）法 4.2 实验步骤 4.2.1样品中还原糖的提取 准确称取2gYE，放在100ml烧杯中，先加10ml蒸馏水搅拌，后加入30ml蒸馏水，混匀，于50℃ 恒温水浴中保温20min，不时搅拌，使还原糖浸出后，过滤，将滤液全部收集在50ml的容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，即为还原糖提取液。 4.2.2 回收率的测定 取等量样品，加入1mL葡萄糖标准溶液，按照同样处理方法提取还原糖，定容，在540nm处测定吸光度。 样品 吸光度 含量 回收率（%） LA 0.434 1.728 100.98 LB 0.226 0.900 109.32 TB 0.631 2.512 112.61 TP 0.478 1.903 101.34 TC 0.609 2.424 97.34 表5 DNS法测定YE中还原糖的含量（g/100g） 标准曲线方程为Y=0.628X，R2=0.9998。测得还原糖含量TB最高为2.512g/100g，LB最低为0.900 g/100g。特征风味YE（TB、TP和TC）还原糖含量要高于基础风味型YE（LA和LB）。回收率在97.34~112.61%，预处理方法达到较好效果。 Ⅱ. 酵母抽提物中滋味肽的分离与鉴定 1. 概述 滋味肽，也称呈味肽，是指从食物中提取或由氨基酸合成得到的对食品风味具有一定贡献的分子质量低于5000Da的寡肽类，包括特征滋味肽和风味前体肽。滋味肽存在于肉类、奶酪、海鲜、水果或蔬菜等各种食物中，无论对于加工食品还是未经加工食品的风味都非常重要。 滋味肽的分离纯化方法很多，根据分子量大小，可以选择超滤、离心等进行初步纯化，然后可以用层析、离子交换、凝胶等进行精制层析，并通过高效液相等进一步分离纯化。本研究结合滋味分析新技术即比较滋味稀释分析，找出最大稀释因子比的馏分对其进行结构鉴定，并对鉴定的多肽在热反应后产生的香味活性化合物进行了初步探索。 2. 滋味肽的分离 2.1 样品前处理 称取YE（LA）10g，加入100ml高纯水，充分溶解。4℃冷冻离心20min，取上清液移入蒸发皿中，薄膜密封后，扎出多数小孔， 在-80℃冷冻干燥。每次准确称取干燥粉末0.010g，定容于10mL容量瓶中，进样。 2.2 凝胶色谱纯化 凝胶色谱纯化依据被分离物的分子量大小不同来进行分离的一种色谱技术。当混合肽溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的肽段先出来，分子量小的物质后出来。肽分离柱Sephadex peptide 10×300mm，柱体积为24mL，洗脱剂为纯水，流速确定为0.3mL/min，检测波长为254nm，上样量为100μL（样品浓度：1mg/100μL)。 蛋白质溶液在238 nm处的光吸收的强弱，与肽键的多少成正比。因此可以用标准蛋白质溶液配制一系列50～500 mg/mL已知浓度的5.0 mL蛋白质溶液，测定238 nm的光吸收值A238，以A238为纵坐标，蛋白质含量为横坐标，绘制出标准曲线。未知样品的浓度即可由标准曲线求得。 2.4 比较滋味稀释分析(cTDA) 将各组馏分冷冻干燥后，称量0.010g两份，一份溶入蒸馏水 (2ml，TDAwater)，一份溶入谷氨酸钠溶液（3mmol/L，TDAMSG )。以2n依次稀释，直至能够品尝到鲜味的最大稀释倍数，即为滋味稀释因子（TD factor）。 3. 滋味肽的鉴定 3.1 样品前处理 准确称量筛选出的干燥成粉的馏分0.010g，用蒸馏水定容于10mL容量瓶中，然后用注射器吸取2.0mL过滤膜于进样瓶，待测。 3.2 HD-MS 进行LC-MS/MS分析的条件 液相条件：nanoACQUITY UPLC超高效液相色谱系统配备自动进样器，富集柱为Symmetry C18，180μm x 20mm，5μm颗粒。分析柱为nanoACQUITY UPLC 超高效液相色谱键合乙烷杂颗粒柱BEH C18，75μm ×250mm, 1.7 μm颗粒。柱温35?C ，流速200nl/min， 流动相A为含0.1%甲酸的水溶液，流动相B为含0.1%甲酸的乙腈。梯度是 1% 到40% B 80min，到80%B 10min，80%B 停留10min，平衡20min到起始1%B。 质谱条件：Synapt High Definition Mass Spectrometry 质谱仪，离子化方式是纳升电喷雾正离子，DDA方式数据采集模式，每次扫描中两个强度最高的离子进行串联质谱分析。 图1 凝胶色谱图 No. Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ Ⅵ Ⅶ Ⅷ Ⅸ Ⅹ I. A 0.115 0.102 0.05