质粒dna的提取和鉴定生物化学与分子生物学.ppt

碱裂解法基本原理 葡萄糖是使悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部，EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂，其主要目的是为了螯合二价金属离子从而达到抑制DNase的活性，避免质粒被酶降解。 NaOH主要是为了溶解细胞，释放DNA，因为在强碱性的情况下，细胞膜发生了从bilayer（双层膜）结构向micelle（微囊）结构的变化；但NaOH易和空气中的CO2发生反应，形成碳酸钠，降低了NaOH的碱性，所以必须用新鲜的NaOH。SDS与NaOH联用，其目的是为了增强NaOH的强碱性，同时SDS能很好地结合蛋白，产生沉淀。这一步要记住两点：第一，时间不能过长，因为在这样的碱性条件下基因组DNA片断会慢慢断裂；第二，必须温柔混合，不然基因组DNA会断裂。 溶液III中的醋酸钾是为了使钾离子置换SDS中的纳离子而形成了PDS，因为十二烷基硫酸钠（sodium dodecylsulfate）遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾 （potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是不溶水的，同时一个SDS分子平均结合两个氨基酸，钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。2 M的醋酸是为了中和NaOH，因为长时间的碱性条件会打断DNA，所以要中和。 75%酒精主要是为了清洗盐份和抑制Dnase。 在一定电场强度下，DNA分子的迁移取决于分子筛效应，即DNA分子本身的大小和构型(相对分子质量不同的DNA片段泳动速度不一样)，且DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同相对分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子：一般来说，其中闭环结构泳动最快，其次为线性结构，最慢的可能是单链开环。 溴化乙锭(EB)是一种荧光染料(3,8-二氨基-5-乙基-6苯基菲啶溴盐)，该物质含有一个可以嵌入DNA的堆积碱基之间的一个平面基团，这个基团的固定位置及其与碱基的密切接近，导致染料与DNA结合并呈现荧光，其荧光产率比游离染料溶液有所增加。DNA吸收254nm处的紫外辐射并传递给染料，而被结合的染料本身则在302nm和366nm有光吸收。这两种情况下，被吸收的能量可在可见光谱红橙区的590nm处重新发射出来。因此，当凝胶中含有游离溴化乙锭时即可以检测到少量的DNA。 实验操作 一 细菌培养与质粒扩增 将微量质粒转化至大肠杆菌中，挑单克隆于LB培养液中培养。 二 质粒提取 取1.5ml培养物倒入 Eppendorf 管中，8000 rpm室温离心1 min； 弃去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥； 将细菌沉淀悬浮于100 μl预冷的溶液I中，剧烈振荡，使沉淀完全分散； 加200 μl溶液II（新鲜配制），盖紧 Eppendorf 管，温和颠倒混合6～8次； 酶切鉴定 质粒溶液 1 μl 10× Buffer H 1 μl 10× BSA 1 μl Bgl II 0.5 μl 无菌水 6.5 μl 充分混匀，37 ℃水浴孵育1-2h。 注意事项 室温下静置1小时左右，凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔位于电场负极； 向电泳槽中加入1×TAE电泳缓冲液，越过凝胶表面即可； 轻轻拔出固定在凝胶中的梳子； 样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻混匀； 上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中，加样量为10 μl ； 盖上电泳槽，接通电源，开始电泳； 电泳条件：电压80v；时间20～25分钟； 电泳结束后，切断电源，取出凝胶。 电泳结果分析： ① 紫外检测仪直接观察电泳条带 ② 摄影记录 预期实验结果 2.4 kb 6.1 kb 2 kb Marker 6 Kb 电泳前，确认样品孔位于电场负极； 因EB存在，全部操作过程要带防护手套； 凝胶浓度选择根据样品DNA分子大小而定，所以电泳前应对DNA片段大小有粗略的估计。 * * 综合性设计性实验-6 质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息学分析 质粒DNA的提取与鉴定 真核表达载体和RNA干扰载体的使用 此实验共包括如下三个部分 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列生物信息学分析部分 第二部分，质粒DNA的提取与鉴定实验操作部分 第三部分，真核表达载体和RNA干扰载体的使用 第一部分，质粒载体的选择以及所插入的外源DNA片段序列的生物信息学分析 质